降脂理肝汤对非酒精性脂肪肝大鼠脂代谢及TNF-α、MDA、APN水平的影响

韩静 李亚伟 刘艳萍 刘宏

(1河北医科大学第二医院体检中心,河北 石家庄 050000；2石家庄市第三医院心内科)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)大部分患者无明显症状，仅有少部分出现消化不良、乏力、肝脾肿大、肝区隐痛等非特异性症状〔1,2〕。NAFLD病情进展缓慢，但可直接导致失代偿期肝硬化、肝细胞癌，并且可诱导2型糖尿病和动脉粥样硬化的发生，影响患者的健康和生活质量〔3〕。目前NAFLD的具体发病机制尚无统一定论，“二次打击”学说是认可度较高的一种理论，该学说认为胰岛素抵抗(IR)导致肝细胞脂质蓄积为第一次打击，在此基础上发生的脂质过氧化等反应、氧化应激和炎症反应可对肝细胞造成损伤，形成第二次打击〔4～6〕。由此可见，脂代谢紊乱、氧化应激和炎症反应是“二次打击”学说中的重要步骤〔7〕。降脂理肝汤为张云鹏教授的临床经验方，临床研究证明，降脂理肝汤治疗NAFLD疗效显著，但其具体的作用机制尚未明确〔8〕。本研究通过观察不同剂量的降脂理肝汤对NAFLD模型大鼠脂代谢指标、炎症因子、氧化应激指标的影响，探讨降脂理肝汤治疗NAFLD的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级SD大鼠50只，购于长沙市天勤生物技术有限公司，合格证号：SCXK(湘)2009-0012。均为雄性，体重130～150 g，平均(142.24±4.36)g，饲养温度22～24℃，相对湿度55%～65%，每天光照12 h，环境噪音≤85 dB。

1.1.2主要药物和试剂 降脂理肝汤以泽泻、丹参为主药，成分为泽泻10 g、丹参10 g、决明子30 g、海藻30 g、郁金10 g、荷叶10 g，药材均来自河北医科大学第二医院药房，配好药方后进行煎煮，制成生药浓度分别为0.46、0.92、1.84 g/ml的浓缩液。肿瘤坏死因子(TNF)-α、脂联素(APN)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.1.3主要仪器 石蜡切片机(德国莱卡公司，RM2235)，全自动生化分析仪(日立，7600)，倒置荧光显微镜(奥林巴斯，ckx41)，全自动酶标生化仪(美国伯乐公司，680)。

1.2实验方法

1.2.1动物分组 适应性喂养1 w后，采用随机数字表法将大鼠分为正常对照组、模型对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10只。

1.2.2造模〔9〕及给药方法 正常对照组采用基础饲料喂养，其余大鼠采用高脂饲料喂养，高脂饲料配比：84%基础饲料+14%猪油+2%胆固醇。均喂养8 w，期间所有大鼠自由活动，自由饮水。8 w后从高脂饲养的大鼠中每组随机抽取1只，脱颈椎处死，取肝组织进行HE染色，根据病理图片判定NAFLD模型大鼠是否造模成功。确定造模成功后，各组剩余的大鼠仍保持之前喂养的方式，并灌胃给药。正常对照组和模型对照组大鼠给予生理盐水5.5 mg/kg灌胃；低、中、高剂量组大鼠分别给予降脂理肝汤2.3、4.6、9.2 g生药/kg体重灌胃。所有大鼠连续灌胃8 w。

1.2.3HE染色 脱颈椎处死大鼠后，取其肝脏，4℃冰浴灭菌生理盐水冲洗，置于10%的甲醛缓冲液中固定24 h，常规脱水包埋后采用石蜡切片机进行连续切片，厚度约为5 μm。取切片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中脱蜡处理，置于100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%、80%、70%的酒精中进行水化处理，自来水冲洗2 min，苏木素染色3 min，自来水冲洗2 min，1%盐酸酒精分化30 s，自来水冲洗2 min，氨水反蓝，自来水冲洗1 min，0.5%伊红液染色3 min，自来水冲洗1 min，置于70%、80%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ的酒精中进行脱水处理，二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液透明，中性树胶封片，光镜下观察。

1.2.4大鼠的一般情况 在实验过程中，观察所有大鼠的精神状况、活动情况、毛发光泽度、饮食情况、排泄情况和死亡情况等。

1.2.5血清学指标测定 连续灌胃给药8 w后下腔静脉采血5 ml，3 000 r/min离心10 min，取上层血清。采用全自动生化分析仪测定总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、游离脂肪酸(FFA)的水平。采用酶联免疫吸附法检测TNF-α、APN水平，具体操作步骤参考试剂盒说明书。

1.2.6肝匀浆指标测定 连续灌胃给药8 w后，取肝组织1 g，加入生理盐水10 ml，制备成10%的肝匀浆，采用酶联免疫吸附法检测肝匀浆中的SOD、MDA水平，具体操作步骤参考试剂盒说明书。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件，多组间计量资料比较采用F检验，两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1HE染色情况 正常对照组肝小叶保持完整的结构，肝细胞索整齐排列，肝细胞呈多边形，核大而圆，无纤维组织增生。造模大鼠肝细胞排列无规律，伴气球样变，存在较明显的炎性细胞浸润，无肝纤维化及肝硬化。见图1。

2.2各组大鼠一般情况 正常对照组大鼠精神状况良好、活动频繁、毛发有光泽、饮食正常、排泄正常、无死亡；模型对照组大鼠精神萎靡、较少活动、毛发油亮且部分大鼠背部毛发脱落、饮食正常、排泄正常、无死亡。低、中、高剂量组大鼠精神一般、时常活动、毛发油亮、饮食正常、排泄正常、无死亡。

2.3各组脂代谢情况 各组TC水平比较无统计学差异(P>0.05)；各组TG、LDL、FFA水平比较存在统计学差异(P<0.05)。模型对照组的TG、LDL、FFA明显高于正常对照组(P<0.05)；高剂量组的TG、LDL、FFA明显低于模型对照组和低剂量组(P<0.05)；中剂量组的TG明显低于模型对照组和低剂量组，LDL明显低于模型对照组，FFA明显低于模型对照组、高于正常对照组(P<0.05)；低剂量组的TG、LDL、FFA明显低于模型对照组、高于正常对照组(P<0.05)。见表1。

图1 典型样本病理改变(×400)

2.4各组TNF-α、APN水平比较 各组TNF-α、APN水平存在统计学差异(P<0.05)。模型对照组的TNF-α明显高于正常对照组，APN明显低于正常对照组(P<0.05)；高剂量组的TNF-α明显低于模型对照组，APN明显高于中、低剂量组、模型对照组(P<0.05)；中剂量组的TNF-α明显低于模型对照组(P<0.05)，APN明显高于低剂量组、模型对照组，低于正常对照组(P<0.05)；低剂量组的TNF-α明显低于模型对照组(P<0.05)，APN明显高于模型对照组、低于正常对照组(P<0.05)。见表1。

2.5各组SOD、MDA水平比较 各组SOD、MDA水平存在统计学差异(P<0.05)。模型对照组的SOD明显低于正常对照组，MDA明显高于正常对照组(P<0.05)；高、中剂量组的SOD明显高于低剂量组、模型对照组，低于正常对照组(P<0.05)，MDA明显低于模型对照组(P<0.05)；低剂量组的SOD明显高于模型对照组、低于正常对照组(P<0.05)，MDA明显低于模型对照组(P<0.05)。见表1。

表1 各组脂代谢情况、TNF-α、APN、SOD、MDA水平比较

与正常对照组比较：1)P<0.05；与模型对照组比较：2)P<0.05；与中剂量组比较：3)P<0.05；与低剂量组比较：4)P<0.05

3 讨 论

随着代谢综合征和肥胖症在全球的流行，NAFLD的患病率明显上升，成为全世界重要的公共卫生问题〔10〕。西药治疗NAFLD疗效单一，且存在不同毒性和不良反应，近年来中医治疗NAFLD的相关研究显著增多，散瘀化浊汤、降脂理肝汤等中药汤剂在临床上也取得了较好的疗效〔11〕。祖国医学认为NAFLD属于“积证”、“痰证”、“胁痛”、“肥气病”等范畴。NAFLD是肝虚、脾虚、肾虚为本，而痰浊瘀血为标的病证，在疾病前期多由于过食肥甘厚味、情志失调、劳逸失度或久病体虚导致肝失疏泄、肝郁气滞、肾阳亏虚、脾失健运，进而导致瘀血阻滞、脂浊积聚，痹阻于肝脏脉络，气血痰瘀互结于胁下，日久肝脏受损〔12,13〕。NAFLD在中医学上可分为肝郁脾虚证、痰湿内阻证、气滞血瘀证、湿热内蕴证、肝阴不足证，其治疗思路为补益肝肾、疏肝健脾、化瘀通络、祛痰泄浊、益气养阴〔14〕。

本研究结果说明NAFLD模型大鼠存在明显的脂代谢紊乱，而降脂理肝汤可改善NAFLD模型大鼠的脂代谢水平，且中剂量和高剂量的疗效更显著。

降脂理肝汤主要由泽泻、丹参、决明子、海藻、郁金、荷叶等六味中药组成，方中泽泻、丹参为主药，其中泽泻利湿降浊、健脾宁心，丹参活血化瘀、清心除烦；决明子、海藻为辅药，决明子清肝明目、润肠通便，海藻利水清热、消痰软坚；郁金为佐药，具有通络止痛、行气化瘀的功效，并可与丹参药性结合，起到疏理肝络、活血化瘀、消除胁痛的作用；荷叶为使药，具有升清降浊、散瘀祛湿的作用。诸药联合共奏补益肝肾、疏肝健脾、气行郁解、痰化浊降、血活瘀消之功效〔15,16〕。

APN是一种胰岛素增敏激素，可激活腺苷酸活化蛋白激酶、抑制Toll样受体4介导的通路，进而增强胰岛素敏感性，改善IR。TNF-α为“二次打击”学说中的重要炎性因子，主要由单核细胞、巨噬细胞、脂肪细胞分泌，可诱导产生多种炎性因子，级联放大炎症反应，促进氧化应激，在NAFLD的发展中起到重要作用。SOD是氧自由基的自然天敌，是生物体内重要的抗氧化酶，能将体内的超氧自由基转化为过氧化氢，过氧化氢再进一步反应转化为水。MDA是氧化终产物，其水平能反映氧化应激程度，且MDA能引起蛋白质、核酸等生命大分子交联聚合，具有一定的细胞毒性〔17,18〕。本研究结果显示，NAFLD模型大鼠APN水平明显下降，且存在明显的炎症反应和氧化应激，而降脂理肝汤可改善NAFLD模型大鼠APN水平，降低炎症反应和氧化应激，这可能是降脂理肝汤治疗NAFLD的机制之一。