基于PI3K/AKT信号通路研究丹酚酸B对成骨细胞骨形成的调控作用

林院 徐杰 罗奋棋 肖毓华

(福建医科大学省立临床学院 福建省立医院骨二科，福建 福州 350000)

成骨细胞引起的骨形成和破骨细胞引起的骨吸收是维持骨代谢平衡的关键节点，如果骨形成低于骨吸收，将引起骨质疏松、骨关节病及风湿性关节病等，反之将引起骨硬化病等疾病〔1,2〕。其中成骨细胞引起的骨形成是骨代谢平衡的关键点之一，此过程需要经历成骨细胞增殖、细胞外基质成熟、矿化及凋亡等过程〔1,2〕。众多信号通路与骨骼系统相关疾病的发生密切相关，特别是Wnt、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)等信号通路，敲除了AKT会引起骨形成延迟，抑制此信号通路活性会导致成骨细胞增殖活性降低，因此，PI3K/AKT信号通路成为骨形成过程中关键信号调控通路〔3,4〕。丹酚酸B是从唇形科鼠尾草属植物中提取出来的一种水溶性单体，具有显著的抗血栓、抗氧化、改善微循环等药理作用〔5,6〕；研究还显示丹酚酸B具有骨代谢调控作用，能够促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化〔7,8〕，对新生的小鼠成骨细胞增殖具有显著的促进作用〔9〕，但是否能够通过此PI3K/AKT信号通路调控成骨细胞骨形成尚未见报道。本课题组将对此展开探讨。

1 材料和方法

1.1细胞株 小鼠成骨细胞MC3T3-E1购于中国科学院细胞库，培养于含有15%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2条件下培养。

1.2试剂与仪器 丹酚酸B购于中国药品生物制品检定所；改良杜氏伊格尔培养基(DMEM)、胎牛血清均购于美国Gibco公司；兔抗人碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)、Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)、骨钙素(OCN)、PI3K、AKT、磷酸化(p)-AKT及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体均购于美国Abcam公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、LY294002均购于南通碧云天生物技术有限公司。ChemiDocTM XRS凝胶成像系统购自美国伯乐公司；FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司；MK3酶标仪购自美国Thermo公司。

1.3细胞分组 ①将0.00，0.01，0.03，0.10，0.30，1.00 nmol/L的丹酚酸B作用于MC3T3-E1细胞；②将细胞分为正常对照组(无任何药物处理)，丹酚酸B组(0.10 nmol/L)，LY294002组(10 μmol/L的LY294002)，丹酚酸B+ LY294002组(0.10 nmol/L丹酚酸B+10 μmol/L LYP4002)。

1.4MTT法检测MC3T3-E1细胞活力 将6×103个MC3T3-E1细胞接种到6孔板，待细胞贴壁后，按“1.3①”分组，并将细胞培养12、24、36 h，加入MTT孵育4 h后再加入150 μl的二甲基亚砜，震荡使结晶物溶解，测定吸光值。

1.5RT-PCR检测ALP、OPN、COLⅠ、OCN mRNA的表达 采用Trizol法抽提取细胞总RNA。于紫外分光光度计上检测总RNA在260或280 mm波长处的光吸收值(OD值)。通过一步法将RNA逆转录为cDNA，最后进行琼脂糖凝胶电泳。ALP：正向:CTCGTTGACCACCTGGAAGAGCTTCAAACCG，反向:GGTCCGTCACGTTGTTCCTGTTCAGC；OPN：正向:CCAAGTAAGTCCAACGAAAG，反向:GGTGATGTCCTCGTCTGTA；COLⅠ：正向:AGGGCTCCAACGAGA-TCGAGATCCG，反向:TACAGGAAGCAGACAGGGCCAACGTCG；OCN：正向:CATGAGAGCCCTCACA，反向:AGAGCGACACCCTAGAC；GAPDH：正向:AGCCACATCGCTCAGACA，反向:TGGACTCCACGACGTACT。

1.6Western印迹检测细胞中蛋白的表达 将9×103个MC3T3-E1细胞接种到6孔板，待细胞贴壁后，按“1.3”分组，并将细胞培养48 h，收集细胞并裂解得到细胞总蛋白，测定蛋白浓度。制作浓缩胶和分离胶，蛋白上样后进行凝胶电泳，湿法转聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脱脂奶粉封闭1 h后，一抗4℃过夜孵育，二抗室温孵育1 h，于凝胶成像系统中曝光。

1.7统计学分析 采用SPSS17.0软件行t检验。

2 结 果

2.1丹酚酸B对MC3T3-E1细胞活力的影响 0.00、0.01、0.03、0.10、0.30、1.00 nmol/L丹酚酸B作用MC3T3-E1细胞12、24、36 h后，随着作用时间延长，0.03、0.10、0.30 nmol/L丹酚酸B能显著提高MC3T3-E1细胞活力(P<0.01)，0.01 nmol/L丹酚酸B对细胞活力影响不大，1.00 nmol/L丹酚酸B虽然能提高细胞活力(P<0.01)，但与0.10 nmol/L丹酚酸B比较促进程度较低。所以，本研究选择0.03、0.10、0.30 nmol/L丹酚酸B作为MC3T3-E1细胞的给药浓度。见表1。

2.2丹酚酸B对MC3T3-E1细胞ALP、OPN、COLⅠ及OCN mRNA表达的影响 0.00、0.03、0.10、0.30 nmol/L的丹酚酸B作用MC3T3-E1细胞12 h，与0.00 nmol/L比较，0.03、0.10、0.30 nmol/L 丹酚酸B能显著上调ALP及OPN mRNA表达；各组丹酚酸B作用MC3T3-E1细胞24 h，与0.00 nmol/L比较，0.03、0.10、0.30 nmol/L能显著上调COLⅠ及OCN mRNA表达量(P<0.01)。见表2。

表1 丹酚酸B对MC3T3-E1细胞活力的影响

与0 nmol/L的丹酚酸B比较:1)P<0.01；表2～4同

表2 丹酚酸B对MC3T3-E1细胞中ALP、OPN、COLⅠ及OCN mRNA表达的影响

2.3丹酚酸B对MC3T3-E1细胞中ALP、OPN、COLⅠ及OCN蛋白表达量的影响 0.00、0.03、0.10、0.30 nmol/L的丹酚酸B作用MC3T3-E1细胞12 h，与0.00 nmol/L比较，0.03、0.10、0.30 nmol/L 丹酚酸B能显著上调ALP及OPN 蛋白表达；作用MC3T3-E1细胞24 h，与0.00 nmol/L比较，0.03、0.10、0.30 nmol/L能显著上调COLⅠ及OCN蛋白表达量(P<0.01)。见表3。

2.4丹酚酸B对MC3T3-E1细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达量的影响 0.00、0.03、0.10、0.30 nmol/L的丹酚酸B作用MC3T3-E1细胞24 h，与0.00 nmol/L比较，0.03、0.10、0.30 nmol/L 丹酚酸B能显著上调PI3K及p-AKT 蛋白表达。见表4。

表3 丹酚酸B对MC3T3-E1细胞中ALP、OPN、COL Ⅰ及OCN 蛋白表达量的影响

表4 丹酚酸B对MC3T3-E1细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响

2.5阻断PI3K/AKT信号通路对丹酚酸B处理的MC3T3-E1细胞中ALP、OPN、COLⅠ及OCN mRNA表达的影响 与正常对照组比较，丹酚酸B组ALP、OPN、COLⅠ、OCN mRNA表达量上调(P<0.01)，LY294002组ALP、OPN、COLⅠ、OCN mRNA表达量下调(P<0.01)。与LY294002组比较，丹酚酸B+ LY294002组ALP、OPN、COLⅠ、OCN mRNA表达量上调(P<0.01)。见表5。

2.6阻断PI3K/AKT信号通路对丹酚酸B处理的MC3T3-E1细胞中ALP、OPN、COLⅠ及OCN 蛋白表达的影响 与正常对照组比较，丹酚酸B组ALP、OPN、COLⅠ、OCN mRNA表达量上调(P<0.01)，LY294002组ALP、OPN、COLⅠ、OCN 蛋白表达量下调(P<0.01)。与LY294002组比较，丹酚酸B+ LY294002组ALP、OPN、COLⅠ、OCN 蛋白表达量上调(P<0.01)。见表6。

2.7阻断PI3K/AKT信号通路对丹酚酸B处理的MC3T3-E1细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响 与正常对照组比较，丹酚酸B组PI3K及p-AKT蛋白表达量上调(P<0.01)，LY294002组PI3K及p-AKT蛋白表达量下调(P<0.01)。与LY294002组比较，丹酚酸B+ LY294002组PI3K及p-AKT蛋白表达量上调(P<0.01)。见表6。

表5 阻断PI3K/AKT信号通路对丹酚酸B处理的MC3T3-E1细胞ALP、OPN、COL Ⅰ及OCN mRNA表达的影响

与正常对照组比较：1)P<0.01；与LY294002组比较：2)P<0.01；下表同

表6 阻断PI3K/AKT信号通路对丹酚酸B处理的MC3T3-E1细胞ALP、OPN、COLⅠ及OCN 蛋白、PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响

3 讨 论

丹参又称为赤参、红根、是唇形科鼠尾草属植物中的一种传统中药，具有活血止痛祛瘀消痈等功效，常被用于心脑血管疾病的治疗当中〔5，6〕。目前从丹参中提取了众多有效单体成分，包括丹参素、丹酚酸B等水溶性成分，丹参酮、隐丹参酮等脂溶性成分，其中作为丹参有效成分的丹酚酸B，是丹参水溶性成分中含量及活性成分较高的单体，除了显著的心血管药理作用外，还能够诱导间充质干细胞定向分化，同时还具有骨代谢调控作用〔5，6〕。如Luo等〔7〕研究显示丹酚酸B能够刺激地塞米松诱导的斑马鱼幼体向成骨细胞分化并基质矿化；Zhang等〔8〕研究证实丹参有效单体成分丹酚酸B通过一氧化氮(NO)途径诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化；范焕琼等〔9〕研究显示丹参酸B能够显著刺激成骨细胞增殖；刘钰瑜等〔10〕研究表明丹酚酸B能够通过抑制地塞米松引起的MC3T3-E1细胞中DKK1 mRNA表达进而促进细胞骨形成，最终发挥其抗骨质疏松作用。而丹酚酸B对成骨细胞骨形成作用机制尚不明确。

本研究结果发现0.03、0.10、0.30 nmol/L丹酚酸B能显著提高MC3T3-E1细胞活力，0.01 nmol/L丹酚酸B对细胞活力影响不大，1.00 nmol/L丹酚酸B虽然能提高细胞活力，但与0.10 nmol/L丹酚酸B比较促进程度较低，所以本研究选择0.03、0.10、0.30 nmol/L丹酚酸B作为MC3T3-E1细胞的给药浓度，此剂量浓度范围与以往研究一致〔9，10〕。ALP是成骨细胞早期分化的标志物，是成骨细胞细胞外基质矿化的启动因子。OPN是成骨细胞中期分化标志物，是基质矿化的调节基因，能够调控成骨细胞与细胞外基质的相互作用，并促进羟基磷灰石形成，成骨细胞矿化并骨形成。COLⅠ是成骨细胞细胞外基质矿化的主要支架，促进成骨细胞的黏附及分化。OCN是中晚期成骨细胞形成的标志物，通过与钙及羟基磷灰石结合促进骨形成。因此，本研究结果提示丹酚酸B能够通过促进骨形成相关蛋白表达进而刺激MC3T3-E1成骨细胞骨形成。

PI3K/AKT信号通路是一种广泛存在于多种组织中的与细胞增殖、分化、凋亡等密切相关的信号转导通路。在受到上游生长因子刺激后，PI3K被激活，激活后的PI3K产物磷脂酰肌醇三磷酸能够结合于AKT，使AKT由细胞质转位到细胞膜，同时构象发生变化，继而引起AKT丝氨酸和苏氨酸位点发生磷酸化，活化后的AKT能够进一步激活下游靶蛋白，参与细胞的生长、分化等过程〔11〕。近些年来已发现PI3K/AKT信号通路及其下游靶蛋白在骨形成及骨重建过程中发挥重要作用〔3，4〕。敲除AKT后会引起小鼠骨化延迟〔3，4〕。在MC3T3-E1细胞中加入LY294002会降低细胞活性，同时使Omentin-1，BMP-2、4、5等诱导剂对成骨细胞骨形成的刺激作用减弱甚至消失〔12，13〕。另外，丹酚酸B能够通过调控PI3K/AKT信号通路保护急性大鼠肾损伤、三氯化物引起的心肌细胞损伤〔14，15〕，提示丹酚酸B对PI3K/AKT信号通路具有显著的调控作用。本研究结果表明丹酚酸B能显著上调PI3K及p-AKT表达。同时，本研究为了进一步证实丹酚酸B是通过PI3K/AKT信号通路刺激成骨细胞骨形成，采用PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002与丹酚酸B共同作用MC3T3-E1细胞，结果表明LY294002能显著减弱MC3T3-E1细胞中骨形成相关基因(ALP、OPN、COL Ⅰ及OCN)的表达，同时还抑制了丹酚酸B对PI3K及p-AKT表达的上调作用，从而说明丹酚酸B确实是通过激活PI3K/AKT信号通路进而刺激MC3T3-E1细胞骨形成。

综上，0.03、0.10、0.30 nmol/L丹酚酸B能显著提高MC3T3-E1细胞活力，上调ALP、OPN、COLⅠ及OCN表达，进而刺激成骨细胞骨形成，此过程是通过激活PI3K/AKT信号通路实现的。