沉默DCR3表达增加卵巢癌细胞对紫杉醇敏感性的实验研究

王芳兰 李玉山 崔彦虎

(1平凉市第二人民医院妇产科，甘肃 平凉 744000；2凉州中医医院普外科；3平凉市人民医院麻醉科)

卵巢癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤，每年有超过20万的新增卵巢癌患者，其临床表现较为隐匿，病理类型较为复杂，有超过50%的患者在确诊时已经处于卵巢癌晚期，手术治疗、化疗、基因靶向治疗等是目前常见的卵巢癌的治疗手段，寻找有效的靶基因提高卵巢癌对化疗药物的敏感性是目前研究的热点〔1〕。诱骗受体(DCR)3是一种肿瘤坏死因子的受体，在人体的胚胎、肝脏等组织中表达水平较低，可以调控细胞的分化、生长、凋亡等过程，参与肿瘤的发生和发展〔2，3〕。研究显示，DCR3在多种肿瘤组织如肺癌、胃癌等中过度表达，参与肿瘤细胞生长过程〔4～6〕。本实验通过慢病毒干扰下调卵巢癌细胞中DCR3的表达，探讨沉默DCR3对卵巢癌细胞生长凋亡及紫杉醇敏感性的作用。

1 材料与方法

1.1材料 卵巢癌细胞ES-2购自BNCC细胞库；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(C-Caspase)-12抗体、DCR3抗体购自加拿大PLLABS；RNA提取试剂盒购自北京solarbio；绿色荧光蛋白(GFP)靶向DCR3慢病毒干扰载体由上海锐赛生物技术有限公司构建；紫杉醇购自美国Caibioclem；Realtime PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；C-Caspase-3、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)抗体购自美国ABCM。

1.2紫杉醇对卵巢癌细胞增殖影响 ES-2细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养，细胞培养液中添加1%的青链霉素，细胞培养条件为：饱和湿度，5% CO2培养箱，温度为37℃。ES-2细胞种植到96孔细胞培养板中，每孔中加入3 000个细胞，培养过夜以后，将培养液吸除，加入含有0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L紫杉醇的细胞培养液继续孵育48 h以后，将细胞培养板取出，在每孔内加入10 μl的细胞计数试剂盒(CCK-8)，放在37℃结合4 h。用酶标仪检测450 nm的OD值。以不含细胞的空白孔调零以后，把0 mol/L紫杉醇处理的细胞存活率计为100%，分析不同浓度紫杉醇处理后卵巢癌细胞存活率变化。

1.3细胞转染和分组 ES-2细胞培养至对数期以后，用胰蛋白酶消化，种植到6孔板内，细胞融合度为30%时进行慢病毒感染，在细胞中添加感染复数(MOI)=20的病毒液，继续培养24 h后，更换成新鲜的细胞培养液。3 d后，在荧光显微镜下观察慢病毒载体上GFP荧光表达水平，感染效率高于80%继续培养。将稳定感染靶向DCR3慢病毒干扰载体和对照载体的ES-2细胞记为干扰组、对照组，用Realtime PCR和Western印迹检测干扰效果。把给予10-6mol/L紫杉醇处理稳定感染靶向DCR3慢病毒干扰载体和对照载体的ES-2细胞记为紫杉醇组、紫杉醇+干扰组。

1.4Realtime PCR检测DCR3表达水平 取对照组、干扰组，按照RNA提取试剂盒说明书将细胞中的总RNA分别提取，在-80℃保存。以逆转录酶进行cDNA合成，步骤同试剂盒说明书，cDNA保存在-80℃。Realtime PCR试剂盒分析DCR3水平，读取内参β-actin和目的基因DCR3的Ct值，按照2-△△CT计算。Realtime PCR程序设置：94℃，5 min(94℃，30 s；60℃，30 s；72℃，10 min)×40个循环。引物序列如下：DCR3上游5′-CTCTTCCTCCCATGACAC-3′，下游5′-CTGGA-AAGCCACAAAGTC-3′。β-actin上游5′-CGTGAAA-AGATGACCCAGATCA-3′，下游5′-CAGCCTGGATGGCTACGTACA-3′。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5Western印迹检测DCR3表达水平 取对照组、干扰组，常规方法提取细胞中的蛋白，蛋白分装后保存在-20℃。以二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量检测试剂盒测定各组蛋白样品的浓度。按照每个上样孔中加入30 μg蛋白进行电泳，上样前同1/4体积的5倍上样缓冲液混合后，在100℃煮沸5 min。十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中电压为：浓缩胶中72 V，观察溴酚蓝到达分离胶和浓缩胶交接处后，将电压调高至120 V继续电泳，直到观察溴酚蓝进入胶块下端边缘约1 cm时，停止电泳。凝胶在80 V电压条件下转膜，转膜置于冰水混合物上进行，转膜时间为90 min。用5%的牛血清白蛋白将电转移后的硝酸纤维素(NC)膜封闭以后，同1∶500倍稀释后的DCR3抗体在4℃过夜反应，再与1∶2 000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗在室温孵育2 h后，用电化学发光(ECL)法显色，检测各组目的蛋白DCR3和内参蛋白β-actin的灰度值，以二者的比值表示DCR3蛋白水平。

1.6细胞克隆实验检测细胞克隆形成能力 对照组、干扰组、紫杉醇组、紫杉醇+干扰组按照上述方法处理后，按照每个孔内加200个细胞接种至6孔板，培养14 d，期间每3 d进行换液1次。把孔内的液体吸除以后，以多聚甲醛固定以后，滴加吉姆萨染液，染色20 min。观察计数大于50个细胞的克隆数目，以细胞克隆数目占接种细胞数目的百分比作为克隆形成率。按照对照组、干扰组、紫杉醇组、紫杉醇+干扰组分组处理细胞，用CCK-8法检测细胞48 h增殖情况，步骤同1.2。

1.7流式细胞术检测细胞凋亡 对照组、干扰组、紫杉醇组、紫杉醇+干扰组按照上述方法处理后，继续培养48 h，胰蛋白酶消化，用磷酸盐缓冲液(PBS)制成单细胞悬浮液，离心后，弃上清，添加200 μl结合缓冲液悬浮各组细胞，加入碘化丙啶(PI)、膜联蛋白(Annexin)V-FITC各5 μl，置于流式细胞仪上检测各组细胞凋亡变化。

1.8Western印迹检测细胞中C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平 对照组、干扰组、紫杉醇组、紫杉醇+干扰组按照上述方法处理后，继续培养48 h，以Western印迹方法测定细胞中C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平，C-Caspase-12、C-Caspase-3抗体以1∶400稀释，CHOP抗体以1∶200稀释。步骤同1.5。

1.9统计分析 应用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差、SNK-q检验。

2 结 果

2.1紫杉醇抑制卵巢癌细胞增殖 紫杉醇浓度：0 mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L的细胞存活率分别为100.00%、(90.15±7.86)%、(76.82±6.38)%、(53.26±4.15)%、(34.15±2.17)%。不同浓度紫杉醇处理后的卵巢癌细胞的存活率逐渐降低，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，10-6mol/L的紫杉醇处理后的卵巢癌细胞存活率约为50%，后续选用10-6mol/L的紫杉醇处理卵巢癌细胞。

2.2慢病毒感染效果检测结果 与对照组比较，干扰组细胞中DCR3 mRNA和蛋白水平均显著降低(均P<0.05)。构建了DCR3表达下调的卵巢癌细胞。见表1，图1。

表1 两组DCR3 mRNA和蛋白水平比较

与对照组比较：1)P<0.05

图1 Western印迹检测DCR3表达

2.3各组细胞存活率及克隆形成率比较 与对照组比较，干扰组、紫杉醇组及紫杉醇+干扰组细胞存活率及克隆形成率均显著降低(P<0.05)。与紫杉醇组比较，紫杉醇+干扰组细胞存活率及克隆形成率均显著降低(P<0.05)。见表2。

2.4各组细胞凋亡率比较 与对照组〔(6.23±0.52)%〕比较，干扰组、紫杉醇组及紫杉醇+干扰组细胞凋亡率均显著升高〔(24.15±2.13)%、(32.52±2.89)%、(46.10±3.27)%；均P<0.05〕。与紫杉醇组比较，紫杉醇+干扰组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见图2。

表2 各组卵巢癌细胞存活率和细胞克隆形成率

与对照组比较：1)P<0.05；与紫杉醇组比较：2)P<0.05；下表同

图2 流式细胞术测定各组细胞凋亡率

2.5各组C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白表达比较 与对照组比较，干扰组、紫杉醇组及紫杉醇+干扰组C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平显著升高(均P<0.05)；与紫杉醇组比较，紫杉醇+干扰组C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平显著升高(P<0.05)。见图3、表3。

图3 Western印迹检测C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平

表3 各组C-Caspase-12、C-Caspase-3、CHOP蛋白水平比较

3 讨 论

DCR3基因定位在人类的20q13.3染色体上，该染色体上多个基因的扩增与肿瘤的发生有关，DCR3在胃、脊髓、脾脏等组织中广泛低表达，而在肿瘤中过度表达〔7，8〕。DCR3基因的cDNA编码的蛋白质含有300多个氨基酸，其N端含有一个信号肽序列，在信号肽序列之后有4个富含半胱氨酸的区域，其在细胞增殖、凋亡等中具有重要作用〔9〕。目前在肺癌、肝癌、胰腺癌等肿瘤组织中发现DCR3过度表达，并且沉默其表达后还可以诱导肿瘤细胞凋亡，下调肿瘤细胞的增殖能力〔10～12〕。DCR3在卵巢癌组织中过表达，其表达水平的高低与肿瘤患者年龄等无关，与肿瘤患者的临床分期、组织分化程度等有关，DCR3可能是卵巢癌治疗的潜在靶点〔13，14〕。本研究显示，沉默DCR3后的卵巢癌细胞增殖能力和细胞克隆能力均降低，说明沉默DCR3发挥卵巢癌细胞生长抑制作用，这与上述研究类似，均表明沉默DCR3抑制肿瘤细胞生长。

紫杉醇主要是从红豆杉属植物中分离出来的一种二萜类化合物，目前广泛用于乳腺癌、卵巢癌等十几种肿瘤的临床治疗中〔15，16〕。紫杉醇具有较好的抗肿瘤效果，其可以通过抑制细胞的有丝分裂、诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用〔17〕。靶向基因增加紫杉醇敏感性是目前研究的重点，也是提高肿瘤治愈率的重要途径〔18〕。本实验结果表明，紫杉醇处理后的卵巢癌细胞的增殖和克隆形成能力降低，同时细胞凋亡水平升高，说明紫杉醇具有在体外抑制卵巢癌细胞的作用，同时本实验还发现，靶向DCR3沉默后的卵巢癌经紫杉醇处理后，细胞凋亡率进一步升高，细胞增殖能力下降更多，说明靶向DCR3沉默可以在体外提高卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性，DCR3可能是提高卵巢癌紫杉醇敏感性的潜在靶点。

细胞凋亡是细胞主动死亡的过程，其发生机制较为复杂，其中内质网应激是近年来发现的一种凋亡途径〔19〕。内质网是蛋白质胆固醇等合成、折叠的重要场所，蛋白质正确折叠是保证细胞正常功能发挥的重要途径，当内质网受到外界因素的刺激以后，细胞中内质网应激标志蛋白CHOP大量表达，诱导Caspase-12活化，引起细胞凋亡发生〔20～22〕。Caspase-12定位在内质网的外膜，其在内质网应激诱导的细胞凋亡中被激活，而与其他凋亡途径无关〔23～25〕。本实验结果显示，沉默DCR3后的卵巢癌细胞经紫杉醇诱导以后，细胞中Caspase-12的活化水平升高，细胞中CHOP蛋白含量升高，同时细胞中凋亡标志蛋白Caspase-3的活化水平也升高，提示靶向DCR3协同紫杉醇通过内质网应激诱导卵巢癌细胞凋亡。

综上，靶向DCR3可能是提高卵巢癌紫杉醇敏感性的途径之一，其可以协同紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡，抑制卵巢癌细胞生长，这为提高肿瘤化疗敏感性提供了新思路，对于提高卵巢癌患者治愈率具有重要意义。本实验只在1株卵巢癌细胞中进行了初步探讨，后续会在多株细胞中进行验证，并且会对其具体的作用机制进行探索。