联合应用小檗碱和二甲双胍对miR-212介导的食管癌细胞迁移的影响

陈智 刘玉珍 齐博 刘尚国 赵宝生

(新乡医学院 1第一附属医院胸外科二病区，河南 卫辉 453100；2食管癌研究所；3河南省神经病学研究所)

根据临床病理分型，我国食管癌多以鳞状细胞癌为主〔1〕。食管癌具有高度侵袭性且易发生转移，上皮-间质转化(EMT)是肿瘤发生侵袭和转移的主要方式。EMT即上皮细胞间质化，是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞并获得迁移和侵袭能力的生物学过程〔2〕。研究发现，micro RNA(miR)异常表达参与肿瘤生物学进展〔3〕。人miR-212(has-miR-212)具有组织特异性，在不同肿瘤组织中表现为抑癌或促癌作用。研究发现，食管癌组织标本中miR-212表达水平升高与术后转移早、生存期短、预后不良显著相关〔4，5〕；另外，雷帕霉素等特定信号通路抑制剂无法阻断食管癌中miR-212高表达介导的促进肿瘤转移的表型。中药提取物小檗碱对食管癌细胞具有抗增殖、促凋亡、抑制迁移的作用〔6〕。二甲双胍不仅能够治疗糖尿病，其广谱的抗肿瘤活性〔7〕在其他肿瘤中已有报道。因此，本文旨在进一步探讨具有广谱抗肿瘤作用的小檗碱与二甲双胍联合用药对miR-212介导的食管癌细胞迁移能力的影响。

1 材料和方法

1.1材料 人食管癌KYSE-450细胞购自南京科佰生物技术有限公司。新生胎牛血清(FBS)购自Clark；RPMI1640培养基、磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)购自Corning；胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、青霉素、链霉素购自索莱宝科技有限公司；小檗碱购自上海源叶生物有限公司；二甲双胍购自碧云天生物技术有限公司。人成熟型miR-212过表达慢病毒载体由上海吉玛基因生物公司合成。单克隆兔抗E-cadherin、Vimentin、Twist1、GAPDH购自CST公司。二喹林甲酸(BCA)试剂盒、辣根过氧化物酶标记的兔抗免疫球蛋白(Ig)G抗体购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2药物配置 小檗碱用DMSO溶解，配置成50 mmol/L的贮存液，-20℃保存，使用前解冻，并用RPMI1640培养基稀释到相应的工作浓度。二甲双胍用PBS配备，制成1 mol/L的贮存液，使用前根据实验所需浓度用PBS进行稀释。

1.3细胞培养 使用含有10%FBS和100 U青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养基，置于37℃、饱和湿润空气、体积分数为5%CO2的培养箱中进行常规培养。待细胞融合至70%～80%，用胰酶消化处理后，计数传代。

1.4慢病毒转染 选取处于对数生长期的细胞用于实验。2×105个KYSE-450细胞于转染前24 h接种在6孔板中。根据上海吉玛基因的细胞转染说明书进行实验操作，并用5 mg/ml的嘌呤霉素对转染细胞进行筛选，从中筛选出能够稳定高表达miR-212的KYSE-450细胞用于后续实验。

1.5Transwell实验 检测药物处理后对细胞迁移的影响 按Transwell说明书操作：①取对数生长期的细胞，经胰酶消化成单个悬浮细胞后，用无血清培养基重悬，计数；②向Transwell小室的上室内加入细胞悬液(含1×105个细胞)，加入无血清的RPMI1640稀释至200 μl；③下室加入600 μl含10% FBS的完全培养基，另外上室和下室中按比例加入稀释过的药物；④置于37℃、5%CO2的培养箱中培养36 h后取出小室；⑤将小室浸入4%多聚甲醛中固定15 min，结晶紫染色8 min，晾干，并吸走小室内的液体，用棉棒将上室内的细胞擦去；⑥每个培养孔随机选5个视野，置于荧光显微镜下进行拍照，并计算各视野下的细胞数，每组实验重复3次。

1.6Western印迹法检测药物处理后EMT相关蛋白的表达 将处于对数生长期的细胞按照上述分组进行处理48 h，用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解细胞后提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度(根据BCA试剂盒说明书进行操作)。以每组30 μg的等量蛋白样品上样，用10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电脉(SDS-PAGE)分离蛋白，转膜，再用5%的脱脂奶粉在常温下封闭1 h，加入E-cadherin、Vimentin、Twist1(1∶1 000)等一抗4℃过夜，用TBST洗膜后(10 min×3次)，加入辣根过氧化物酶标记兔抗IgG(1∶8 000)室温摇床上孵育1 h，再洗膜30 min，除去未结合的二抗，最后根据说明书按照1∶1配置电化学发光(ECL)工作液，用凝胶成像仪成像。

1.7统计学处理 采用SPSS22.0软件进行方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1小檗碱、二甲双胍对miR-212介导的KYSE-450细胞迁移的影响 与对照组比，过表达miR-212后促进了细胞迁移能力(P<0.05)。不同浓度小檗碱(10 μmol/L和20 μmol/L)作用于过表达miR-212的KYSE-450细胞后，与miR-212组(未加药处理)相比，呈浓度-剂量依赖性出现抑制细胞迁移能力的作用(P<0.001)。给予10 mmol/L和20 mmol/L二甲双胍处理后，与miR-212组(未加药处理)相比，其抑制作用具有浓度-剂量依赖性，随浓度增加抑制作用逐渐明显(P<0.001)。见图1、2，表1。

图1 小檗碱对过表达miR-212的KYSE-450细胞迁移的影响(结晶紫染色，×100)

图2 二甲双胍对过表达miR-212的KYSE-450细胞迁移的影响(结晶紫染色，×100)

2.2小檗碱和二甲双胍联合对miR-212介导的KYSE-450细胞迁移的影响 过表达miR-212的KYSE-450细胞迁移细胞数〔(555.67±5.69)个〕显著高于对照组〔(363.67±5.13)个，P<0.05)〕。 miR-212+10 μmol/L小檗碱组细胞迁移细胞数〔(419.32±4.00)个〕和miR-212+10 mmol/L二甲双胍组细胞迁移细胞数〔(504.27±5.29)个〕均显著低于对照组，且显著高于miR-212+10 μmol/L小檗碱+10 mmol/L二甲双胍组〔(197.36±5.57)个〕，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。

表1 小檗碱、二甲双胍对过表达miR-212的KYSE-450细胞迁移的影响个，n=3)

与对照组比较：1)P<0.05；与miR-212组(未加药处理)比较：2)P<0.05；下表同

图3 小檗碱和二甲双胍联合对miR-212介导的KYSE-450细胞迁移的影响(结晶紫染色，×100)

2.3Western印迹法检测药物处理后E-cadherin、Vimentin、Twist1蛋白水平 与对照组相比，过表达miR-212组(未加药处理)E-cadherin表达下调(P<0.05)，Vimentin、Twist1表达上调(P<0.05)；两种药物联合处理后，与过表达miR-212组(未加药处理)相比，E-cadherin表达明显增加，Vimentin、Twist1的表达显著下降(P<0.05)，见表2、图4。

表2 Western印迹法检测小檗碱和二甲双胍对EMT相关蛋白表达的影响

图4 Western印迹法检测小檗碱和二甲双胍处理后对EMT相关蛋白的表达情况

3 讨 论

肿瘤获得转移和侵袭能力的重要标志是发生EMT。研究发现，肿瘤细胞发生EMT后，癌细胞之间的黏附性下降，发生解离，上皮细胞获得间充质细胞的表型并由此增加迁移和侵袭的能力〔8〕。文献报道，miRNA与多种肿瘤的发生发展及预后密切相关〔9〕。miRNA是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA分子，并参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等一系列重要的生物学过程〔10〕。研究发现，miRNA的表达水平对EMT发生有促进或抑制作用〔11〕。miR-212定位于染色体17p13.3上，参与多种肿瘤的生物学进展。如在胰腺癌中miR-212表达上调作为促癌基因参与肿瘤发展〔12〕；相反，miR-212在肝细胞癌中表达下调作为肿瘤抑制因子发挥作用〔13〕。本研究显示miR-212的高表达水平能够促进食管癌细胞的迁移和侵袭能力。因此，通过miRNA调节并干预食管癌细胞的生物学进展，找到具有治疗潜力的miRNA的靶点药物，能够提高食管癌临床治疗手段。

前期研究显示，给予LY294002(磷脂酰肌醇三激酶抑制剂)、雷帕霉素(靶蛋白抑制剂)等肿瘤相关经典信号通路抑制剂，不能抑制miR-212介导的促进食管癌细胞迁移的能力。因此推测，miR-212过表达能够激活下游多条信号通路，从而促进EMT转化过程。

小檗碱又名黄连素，具有抗炎、抗菌、抗糖尿病等〔14,15〕作用。二甲双胍能够抑制食管癌〔16〕、乳腺癌〔17〕等肿瘤细胞的生长，其潜在的广谱抗肿瘤活性也被广泛研究。肿瘤的联合用药是指利用不同药物之间的协同作用以取得比单一药物更好的效果〔18〕，通过减低药物剂量达到减少药物毒副作用目的，并增强药物疗效，有效抑制肿瘤生长，防止肿瘤的侵袭和转移〔19〕。将广谱抗肿瘤药物小檗碱和二甲双胍联合用药，能有效地提高抗肿瘤药物的活性，达到抑制肿瘤细胞生长的目的。

本实验表明，低剂量的小檗碱、二甲双胍单独处理miR-212过表达的KYSE-450细胞，未能有效抑制细胞迁移能力；将二者联合应用后，对细胞迁移能力的抑制作用显著增强，表明低剂量的小檗碱与二甲双胍联合后，对高表达miR-212的KYSE-450细胞的迁移能力具有显著的协同抑制作用，其作用机制可能是通过抑制食管EMT及抑制转录因子Twist1的表达。