ADAMTS9基因联合去甲氧基姜黄素对肝癌细胞侵袭迁移及PI3K/PTEN/AKT信号的影响

徐卓 张萌 张志磊 贾聿明 王超 彭利

(河北医科大学第四医院肝胆外科，河北 石家庄 050011)

肝癌是常见的消化系统肿瘤之一，早期临床症状不明显，起病隐匿，进展迅速，确诊时大部分患者已处于晚期或已发生远处转移，且近些年我国的肝癌发病率呈现上升趋势〔1〕。肿瘤进展过程中，肿瘤细胞的侵袭及转移能力发挥重要作用。因此，寻找有效的肝癌治疗途径具有重要意义。带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解联蛋白金属蛋白酶(ADAMTS)9是ADAMTS家族成员之一，是该家族中结构最为保守的成员，在乳腺癌、胃癌等多种肿瘤中发挥抑癌基因样作用〔2，3〕。肝癌组织中ADAMTS9下调表达，与发生及预后有关〔4〕，ADAMTS 9启动子异常甲基化可能参与肝细胞癌的形成和进展〔5〕，但关于ADAMTS9对肝癌细胞生物学特性影响尚未明确。去甲氧基姜黄素(DMC)是姜黄素的衍生物，已被证实有确切的抗肿瘤活性，且可减轻一些肿瘤致癌因素对机体造成的损伤，也可抑制肿瘤侵袭和迁移〔6〕。有研究显示，DMC可抑制肝癌细胞增殖、侵袭、迁移〔7〕。本研究旨在ADAMTS9过表达或DMC单独或联合对肝癌细胞侵袭、迁移及磷脂酰肌醇3-激酶/第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白/蛋白激酶B(PI3K/PTEN/AKT)信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂和仪器 RPMI1640培养基购自美国Corning；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青；细胞计数试剂盒(CCK)8购自上海生工；去甲氧基姜黄素购自上海皓元；Transwell小室试剂盒购自美国Corning；Matrigel基质胶购自美国BD；ADAMTS9、增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、PI3K、PTEN和p-AKT抗体购自美国CST；酶标仪购自美国Bio-Rad。

1.2细胞株 人正常肝细胞HL-7702、肝癌细胞系HepG2、人肝癌低转移MHCC 97-L细胞及人肝癌高转移MHCC97-H细胞系均购自美国ATCC。细胞在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，于5%体积分数二氧化碳(CO2)、饱和湿度的培养箱中37℃恒温传代培养。

1.3细胞中ADAMTS9表达检测 采用Western印迹法。细胞中加适量裂解液于冰上裂解反应30 min，Bradford法定量蛋白。蛋白样品在100℃水浴中变性5 min，加适量上样缓冲液，每孔道上样30 μg，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，经100 V湿转1.5 h，转膜完成后用5%的脱脂奶粉封闭膜1～2 h，加一抗(1∶500稀释的ADAMTS9抗体)，4℃冰箱中过夜，加1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温摇晃1～2 h，洗涤。暗室中压上X线片，采用ECL化学发光法检测，曝光约60 s，即刻进行显影、洗片，扫描仪进行扫描并测定。Quantity软件分析ADAMTS9蛋白与内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)灰度值，以其比值作为各个蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.4实验分组及处理 MHCC97-H细胞分为4个处理组，即对照组、pcDNA3.1-ADAMTS9组、DMC和pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC组。对照组细胞不经特殊处理。pcDNA3.1-ADAMTS9组转染ADAMTS9的过表达载体48 h，转染参照LipofectamineTM 2000转染说明。DMC组使用40 μmol/L DMC处理细胞48 h。pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC组用pcDNA3.1-ADAMTS9及40 μmol/L DMC共同处理细胞48 h。

1.5细胞活力检测 采用CCK8法。以5×103/孔接种生长至对数期的MHCC97-H细胞于96孔板，常规培养24 h，按照1.4分组处理，每组设置5个重复孔，收集处理至规定时间的细胞，每孔中加入10 μl的CCK8溶液，培养箱孵育2 h，于450 nm，酶标仪测定吸光度值(A)。实验重复3次。

1.6细胞侵袭能力检测 采用Transwell小室检测细胞侵袭能力。实验分组及处理同上。Transwell小室置于24孔培养板，形成上、下两室。上室面均匀铺上50 μl由不含血清培养基稀释的Matrigel，置于37℃培养箱中。将处理至规定时间的4组细胞浓度调整为2.5×105/ml，每个上室中加入细胞悬液100 μl，下室中加入含10%FBS的培养液500 μl，于37℃、5%体积分数CO2培养箱中孵育24 h。棉签轻轻拭去上室面的细胞，依次经4%多聚甲醛固定、0.1%结晶紫染色后，随机计数5个高倍视野下(×200)侵袭至滤膜下表面的细胞数，取均值。实验重复3次。

1.7细胞迁移能力检测 采用Transwell小室检测细胞迁移能力。除了未铺Matrigel，其他步骤同细胞侵袭实验。

1.8PCNA、MMP-2、MMP-9、PI3K、PTEN和p-AKT蛋白表达检测 方法同1.3。

1.9统计学方法 采用SPSS21.0软件进行方差分析及SNK-q检验。

2 结 果

2.1ADAMTS9在肝癌细胞表达 肝癌HepG2、MHCC97-L和MHCC97-H细胞中ADAMTS9表达(0.204±0.021、0.165±0.018、0.074±0.010)均有不同程度的降低，与正常肝细胞HL-7702(0.602±0.056)比较，差异具有统计学意义(F=163.674，P=0.000)。见图1。

图1 Western印迹检测肝癌细胞ADAMTS9蛋白表达

2.2pcDNA3.1-ADAMTS9转染MHCC97-H细胞效果 pcDNA3.1-ADAMTS9组ADAMTS9的蛋白表达(0.625±0.059)显著高于对照组(0.088±0.010，P<0.05)，而pcDNA3.1组ADAMTS9的蛋白表达(0.096±0.012)与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 pcDNA3.1-ADAMTS9转染MHCC97-H细胞后ADAMTS9的蛋白表达

2.3过表达ADAMTS9或DMC对MHCC97-H细胞活力的影响 pcDNA3.1-ADAMTS9和DMC组MHCC97-H细胞活力(0.541±0.048、0.482±0.043)显著低于对照组(0.754±0.065，P<0.05)，而pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC组对细胞活力抑制更明显(0.312±0.030)，且显著高于pcDNA3.1-ADAMTS9和DMC组(P<0.05)。

2.4过表达ADAMTS9或DMC对MHCC97-H细胞侵袭及迁移能力的影响 pcDNA3.1-ADAMTS9组和DMC组细胞侵袭及迁移数均显著低于对照组，而pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC组细胞侵袭及迁移数均显著低于pcDNA3.1-ADAMTS9组和DMC组(P<0.05)。见表1。

2.5过表达ADAMTS9或DMC对MHCC97-H细胞增殖及侵袭迁移相关蛋白表达的影响 pcDNA3.1-ADAMTS9组和DMC组细胞PCNA、MMP-2和MMP-9的蛋白表达均显著低于对照组，而pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC组细胞PCNA、MMP-2和MMP-9的蛋白表达均显著低于pcDNA3.1-ADAMTS9组和DMC组(P<0.05)。见图3，表2。

表1 过表达ADAMTS9或DMC对MHCC97-H细胞侵袭及迁移能力的影响

与对照组比较：1)P<0.05；与pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC组比较：2)P<0.05，下表同

图3 Western印迹检测各组细胞 PCNA、MMP-2和MMP-9的蛋白表达

表2 PCNA、MMP-2和MMP-9的蛋白相对表达比较

2.6过表达ADAMTS9或DMC对MHCC97-H细胞PI3K/PTEN/AKT信号的影响 pcDNA3.1-ADAMTS9组和DMC组细胞PI3K和p-AKT的蛋白表达均显著低于对照组，PTEN的蛋白表达显著高于对照组(P<0.05)，而pcDNA3.1-ADAMTS9+DMC组细胞PI3K和p-AKT的蛋白表达均显著低于pcDNA3.1-ADAMTS9组和DMC组，PTEN的蛋白表达均显著高于pcDNA3.1-ADAMTS9组和DMC组(P<0.05)。见图4，表3。

图4 Western印迹检测PI3K、PTEN和p-AKT的蛋白表达

表3 PI3K、PTEN和p-AKT蛋白的相对表达比较

3 讨 论

ADAMTS9在血管内皮、心脏、卵巢等组织中有广泛表达，定位于3p14.2-p14.3染色体，已有研究报道该区域在鼻咽癌、食管鳞癌等多种肿瘤中缺失〔8〕。乳腺癌中ADAMTS9的上调表达可抑制癌细胞转移〔9〕；外源性的ADAMTS9表达可抑制结肠癌细胞增殖和迁移，阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡，同时可抑制AKT信号通路〔10〕。这提示ADAMTS9是一个重要的抑癌基因，其可能在肝癌中发挥重要作用。本研究首先检测了肝癌细胞ADAMTS9表达，发现肝癌细胞ADAMTS9均为低表达，在肝癌高转移MHCC97-H细胞表达最低，因此选择作为研究对象。

DMC为姜黄素的衍生物，具有抗纤维化、抗氧化、抗炎、抗癌等作用，其抗癌机制受到广泛关注〔11〕。有研究发现，DMC可抑制多种恶性肿瘤的生长和转移，如肺癌、肝癌、白血病等，且抗癌谱较广，毒副作用小〔12，13〕。作为抗癌新药，具有很好的应用前景。本研究结果提示ADAMTS9和DMC联合可能是一种新的肝癌治疗途径。

肿瘤的侵袭及转移是恶性肿瘤临床治疗的一个棘手难题。已有研究显示DMC抑制肿瘤侵袭及转移机制与降解细胞外基质蛋白水解酶有关〔14〕。MMP-2和MMP-9是MMPs家族成员之一，可特异性降解Ⅳ型胶原，肝癌中抑制MMP-2和MMP-9表达可降低癌细胞的侵袭及迁移能力〔15〕。PCNA为一种核蛋白，在细胞周期S期有广泛表达，其表达程度可反映细胞的增殖能力，目前已在多种恶性肿瘤增殖活性检测中有广泛应用〔16〕。本研究结果显示，过表达ADAMTS9及DMC均可下调PCNA、MMP-2和MMP-9表达，联合对PCNA、MMP-2和MMP-9表达抑制更明显。

PI3K/AKT信号在多种人类肿瘤中表达失调，AKT被PI3K磷酸化激活后可促进细胞增殖、侵袭和迁移，抑制细胞凋亡，是该通路的效应核心〔17〕。PTEN是一种重要的抑癌基因，可负反馈调节PI3K/AKT信号，其表达缺失可引起肿瘤进展、预后不良和淋巴结转移〔18〕。PTEN能使PI3K去磷酸化，失去对AKT的激活，从而抑制PI3K/AKT信号，因此大多数学者称之为PI3K/PTEN/AKT信号通路〔19〕。有研究显示，罗格列酮可通过PI3K/PTEN/AKT通路抑制人肝癌HepG2细胞增殖〔20〕。ADAMTS9可通过抑制AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在胃癌中发挥功能性肿瘤抑制作用〔21〕。本研究结果提示ADAMTS9或DMC对肝癌细胞侵袭迁移的影响与PI3K/PTEN/AKT信号有关。

综上，过表达ADAMTS9及DMC均可抑制肝癌细胞活力、侵袭和迁移能力，两者联用对细胞抑制作用更明显，机制可能与下调PCNA、MMP-2和MMP-9及PI3K/PTEN/AKT信号通路有关。本研究提示过表达ADAMTS9及过表达ADAMTS9和DMC联合可能是肝癌治疗的新的途径。但本研究内容有限，还需更多的体内、体外及临床研究证实。