超声造影定量参数联合血清TSHR mRNA用于甲状腺癌老年患者临床诊断的价值

黄莺 李奇林 张存程 杜雅灵

(重庆市人民医院超声科，重庆 400014)

国际癌症研究机构指出，近30年来，甲状腺癌发病率约占恶性肿瘤的1%，是发病率增长速度排第3位的恶性肿瘤，与CT、超声造影(CEUS)、细针穿刺等早期诊断技术的广泛应用密切相关〔1〕。然而，甲状腺癌是预后良好的恶性肿瘤，其早发现、早诊断和早治疗并不会明显降低死亡率，改善预后〔2〕。相反，部分患者需承受手术和并发症带来的痛苦，甚至部分患者余生需采用甲状腺素替代甚至抑制疗法，导致健康受损。因此，对于甲状腺癌的诊断，应选择敏感、准确的筛查指标，特别是可以预测肿瘤的恶性程度和预后的非侵入性指标〔3〕。促甲状腺激素受体(TSHR)〔4〕能够与TSHR抗体结合触发生物化学级联反应，从而调节甲状腺激素的释放。有研究显示，TSHR mRNA在甲状腺癌患者血清中高表达，与肿瘤的恶性程度相关，能在一定程度上反映预后，是甲状腺癌诊断的分子标志物〔5〕。本研究采用CEUS联合血清TSHR mRNA用于甲状腺癌老年患者临床诊断价值。

1 资料与方法

1.1基本资料 重庆市人民医院于2016年1月至2017年3月期间收治的90例疑似甲状腺癌的老年患者，其中男51例，女39例，年龄60～76岁，平均(68.5±5.4)岁，病程20 d至20年，平均(4.6±2.8)年。纳入标准：①具有完整的手术和甲状腺功能测定资料；②患者均行手术病理检查；③不患有其他恶性肿瘤；④患者及其家属知情同意，签署知情同意书。排除标准：①合并心脑血管疾病者；②糖尿病、高血压患者；③肺结核患者；④合并其他恶性肿瘤；⑤合并严重器官衰竭。依据手术病理学诊断分为甲状腺癌组和良性组，甲状腺癌组62例，男35例，女27例，年龄(67.9±4.9)岁，病程(4.5±3.1)年，病灶位于左侧24例，右侧27例，双侧5例，峡部6例；病理类型乳头状癌29例，滤泡癌9例，髓样癌7例，混合癌14例，隐性癌3例；良性组28例，男16例，女12例，年龄(69.8±5.7)岁，病程(4.8±2.6)年，病灶位于左侧8例，右侧10例，双侧4例，峡部6例；病理类型结节性甲状腺肿8例，甲状腺瘤17例，其他甲状腺结节3例。两组基本资料差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2CEUS检查 采用Philips iU 22彩色多普勒超声诊断仪，探头频率8～12 Hz，对比脉冲序列呈现软件，造影剂为注射用六氟化硫微泡(声诺维，SonoVue，生产厂家为Bracco International B.V，每支含59 mg六氟化硫)，使用前向冻干粉剂中加入5 ml生理盐水，振摇混匀，呈均匀混悬液。

患者仰卧，调整为常规超声模式，选择病灶血流最丰富的切面，切换至造影模式，经肘静脉团注2.5 ml造影剂，随即快速注射5 ml生理盐水，记录超声造影图像。整个造影过程中禁止吞咽动作，探头固定在肿块最大切面处不动，图像采集时间>2 min，数据存储至硬盘，脱机分析。将图像导入Qontrast4.0定量分析软件，分别选择3个感兴趣区(ROI)，得出ROI造影剂增强时间-强度曲线，采用伽马曲线模型拟合，得出拟合峰值曲线强度(PEAK)、达峰时间(TTP)、造影剂平均通过时间(MTT)、最大灌注强度(SImax)和平均灌注强度(SImean)，计算3个ROI的平均值。

1.3血清TSHR mRNA测定〔6〕。①绘制标准曲线：采用cRNA标准品，稀释至不同的浓度，经RT-PCR操作，构建标准曲线；②样品测定：手术病理学检查前1 d，取空腹肘静脉血5 ml，采用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离单核细胞，采用TRIzol试剂提取总RNA，采用RT-PCR法测定外周血中TSHR mRNA表达水平。RT-PCR步骤：上游引物：5′-GCTTTTCAGGGACTATGCAATGAA-3′，下游引物5′-AGAGTTTGGTCACAGTGACGGGAA-3′，扩增片段长度为212 bp；GAPDH上游引物：5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′，GAPDH下游引物：5′-TCACGCCACAGTTTCCCGGA-3′。先在94℃预变性5 min，然后进行94℃ 1 min、54℃ 1 min、72℃ 1 min循环38次，72℃延伸10 min。采用循环荧光检测系统和一步法SYBR Green 定量PCR 试剂盒测定血清TSHS mRNA水平。

1.4诊断标准 ①CEUS：以手术病理结果为金标准，绘制PEAK、TTP、MTT、SImax和SImean诊断甲状腺癌的ROC曲线，将约登指数(灵敏度和特异度之和减1)最大值对应的界值作为最佳诊断临界值；②TSHR mRNA：浓度>1.02 ng/μg即可诊断为甲状腺癌〔7〕；③联合诊断：选择诊断准确度最高的CEUS定量参数SImax联合TSHR mRNA诊断，二者均诊断为甲状腺癌时，即可确诊。

1.5研究方案 ①比较甲状腺癌和良性患者CEUS定量参数和血清TSHR mRNA水平差异；②绘制CEUS定量参数诊断甲状腺癌的ROC曲线，寻找甲状腺癌诊断效能最佳的CEUS参数；③采用CEUS定量参数联合TSHR mRNA诊断甲状腺癌，计算灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值。

1.6统计学处理 采用SPSS19.0软件进行χ2检验，t检验。

2 结 果

2.1两组CEUS定量参数和血清TSHR mRNA水平比较 两组CEUS参数PEAK、SImax、SImean、血清TSHR mRNA水平差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组CEUS定量参数和血清TSHR mRNA水平比较

2.2CEUS定量参数诊断甲状腺癌的诊断效能分析 PEAK、SImax、SImean诊断甲状腺癌的ROC曲线下面积分别为0.720、0.744和0.716，最佳cutoff值分别为34.3、60.5和32.0。以手术病理结果为金标准，采用PEAK、SImax、SImean诊断甲状腺癌，三者诊断甲状腺癌的敏感度、准确度差异有统计学意义(P<0.05)，其中SImax诊断的敏感度、准确度最高(P<0.05)。见图1，表2。

2.3CEUS定量参数联合TSHR mRNA诊断甲状腺癌的诊断效能分析 以手术病理结果为金标准，TSHR mRNA+ SImax诊断甲状腺癌的特异度和准确度显著高于TSHR mRNA(P<0.05)。见表3。

图1 CEUS参数PEAK、SImax、SImean诊断甲状腺癌ROC曲线

表2 CEUS定量参数诊断甲状腺癌的诊断效能分析

与PEAK、SImean诊断相比:1)P<0.05

与TSHR mRNA诊断相比:1)P<0.05

3 讨 论

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，发病率呈增高趋势。目前，甲状腺癌的临床诊断主要为细针穿刺细胞学检查和超声，其中，穿刺检查为有创检查，存在5%的假阳性和5%的假阴性〔8〕；超声检查的广泛开展提高了甲状腺癌的检出率，但特异性较低，导致部分良性患者因高度怀疑而接受了手术，使得我国的甲状腺癌的诊治出现“过度诊断”和“过度治疗”的局面〔9〕。为此，本研究选择甲状腺癌诊断特异性较高的TSHR mRNA联合超声检查诊断甲状腺癌，以提高诊断的准确性。

超声造影定量检测技术是国内竞相开展的新技术，通过静脉快速团注造影剂，获取病灶内的时间-强度曲线(TIC)，以此评价病灶的灌注情况。PEAK、TTP、MTT、SImax和SImean是超声造影定量测定的主要参数，甲状腺癌在TIC上主要表现为TTP、MTT短，呈慢进快出低增强〔10〕。有研究显示〔11〕，甲状腺癌的生长、转移和侵袭以微血管的形成为基础，而CEUS定量参数与微血管密度密切相关，可评价肿瘤血管生成情况，故CEUS定量参数可用于甲状腺癌的诊断。本研究与胡瑛〔12〕、陈立斌〔13〕报道结果基本一致。甲状腺癌内部血管多、分布不均匀、有不规则分支、血管网分布杂乱，所以甲状腺癌和良性患者TTP、MTT无显著性差异；而SImax与微血管密度的相关系数最高〔11〕，故诊断的准确性最佳。

TSHR蛋白基因是与甲状腺癌相关的基因，在未分化癌中不表达，在分化型甲状腺癌和低分化癌中均表达，能够反映甲状腺癌的恶性程度和预后〔14〕。有研究显示〔15〕，外周血中TSHR mRNA能够反映甲状腺癌细胞的侵袭特性，甲状腺癌患者血清TSHR mRNA表达水平高。国外研究显示〔16〕，TSHR mRNA检测可提高一些细针穿刺不能确定的诊断的准确性。本研究与Chia等〔6〕报道的基本一致，较刘佳等〔17〕报道的特异度87.5%稍低，可能与选择的结节病例有关。据Milas等〔18〕报道，约有27%的甲状腺癌患者和10%的良性患者TSHR mRNA的表达值相对接近，故尽管TSHR mRNA诊断甲状腺癌准确度较高，但仍有一定的漏诊率。

影像学技术联合血清分子标志物诊断已成为甲状腺癌诊断的研究热点，影像学诊断的高敏感度和分子标志物诊断的高特异度有助于提高甲状腺癌诊断的准确性。文献〔19〕报道联合超声检查和基质金属蛋白酶诊断甲状腺癌，诊断准确性由73.32%提高至85.50%；刘佳等〔17〕联合99mTc-MIBI 亲肿瘤显像TSHR mRNA诊断甲状腺结节，诊断准确性由72.72%提高至87.27%。本研究结果表明联合诊断提高了甲状腺癌诊断的准确性。Milas等〔18〕指出，TSHR mRNA对于分化型甲状腺癌的预测达到96.0%，而95%的患者检测不到TSHR mRNA表达，但超声显示为恶性，病理结果显示为良性结节；Qiu等〔20〕认为TSHR mRNA对诊断甲状腺癌微小癌是一个很好的补充；而对于TSHR mRNA表达值相近的甲状腺癌和良性患者，超声造影参数为其诊断提供了补充，故联合诊断的准确性显著提高。另外，本研究中，TSHR mRNA联合CEUS诊断甲状腺癌，误诊的11例患者中，1例甲状腺肿块误诊为阳性，3例乳头状癌、2例滤泡癌、1例髓样癌、2例混合癌、2例隐性癌误诊为阴性，显示联合诊断的误诊情况与甲状腺癌的病理类型并无显著相关性。总之，CEUS定量参数SImax与TSHR mRNA的联合应用能够更准确地诊断甲状腺癌，提高了诊断的特异度和准确度，克服了单一检查的弊端，为临床高度怀疑却不能确诊的甲状腺癌患者提供了一种新的诊断方法，对于避免良性患者手术具有重要意义。但是，是否CEUS多参数联合TSHR mRNA诊断甲状腺癌的诊断效能更好，有待于进一步研究。