不稳定型心绞痛患者miR-9-3p水平及临床意义

李斯 孙雅楠

(唐山市工人医院 1心内四科，河北 唐山 063000；2内分泌二科)

miR-9-3p是microRNA(miR)家族成员之一，其基因定位于人15号染色体。目前研究证实血浆中miR-9-3p能够参与机体胆固醇代谢、调节心肌细胞血管新生能力及心肌的生物学功能〔1～3〕。冠心病(CHD)患者血浆miR-9-3p表达水平的研究鲜有报道。本研究分析冠状动脉病变严重程度Gensini评分与血浆miR-9-3p表达水平的相关性，旨在探讨血浆miR-9-3p水平在CHD病情评估及诊疗中的价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 2014年1月至2015年6月唐山市工人医院心内科就诊的不稳定型心绞痛(UA)患者50例为UA组，纳入标准：(1)参照2011《美国心脏学会/美国心脏病学会不稳定型心绞痛/非ST段抬高心肌梗死指南》及加拿大心绞痛分级3/4级标准，且必须具有以下至少一个特征：①1个月内原有心绞痛加重或发作频繁(发作频率增加，时间延长，程度加重)；②病程在1个月以内新发生的心绞痛(从无心绞痛，或有心绞痛病史但在半年内未发生心绞痛)；③静息型心绞痛：心绞痛发生在休息或安静状态；④发作持续时间相对较长，含硝酸甘油效果欠佳，病程在1个月内。(2)冠状动脉造影显示至少一支冠状动脉血管直径狭窄≥50%。排除标准：(1)先天性心脏病、心脏瓣膜病患者、严重充血性心力衰竭〔纽约心脏病协会(NYAH)分类Ⅳ级〕或心源性休克。(2)伴有肾脏疾病、肝脏疾病、免疫性疾病、恶性肿瘤、血栓性疾病、严重贫血和出血性疾病等；(3)伴有各种急慢性炎症及创伤等情况；(4)血压≥180/110 mmHg者。同期年龄、性别与之相匹配的健康体检人员30例为对照组。本研究由唐山市工人医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2标本采集 研究对象均禁食8 h，于冠脉造影前，清晨空腹肘静脉采血。

1.3冠脉造影检查 患者均具有冠状动脉造影指征且无禁忌证，由经验丰富的心血管介入医师行冠状动脉造影术，必要时行球囊扩张及支架植入术。根据世界卫生组织(WHO)推荐的美国AHA血管分段标准将冠状动脉分为15段，根据Gensini评分准则确定冠状动脉粥样硬化的严重程度，将病变血管分为左主干、左前降支、回旋支和右冠状动脉；每支血管根据狭窄程度进行分值设定：管腔狭窄≤25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计4分，76%～90%计8分，91%～99%计16分，100%完全闭塞计32分；不同节段冠状动脉乘以相应系数：左主干病变×5.0；左前降支近段×2.5，中段×1.5，远段×1.0；第一对角支×1.0；第二对角支×0.5；左回旋支近段×2.5，中段×1.5，远段和后降支均×1.0，后侧支×0.5；右冠状动脉近、中、远段和后降支均×1.0。Gensini评分为各节段冠状动脉血管分值之和，得分越高说明狭窄程度越严重。

1.4血浆总RNA的提取 使用mirVana Paris试剂盒提取血浆总RNA，按照说明书操作，置于-80℃冰箱冻存。

1.5cDNA合成 应用实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)(Taqman探针法)配制RT-PCR反应体系，总反应体系共8 μl，10×缓冲液0.8 μl、dNTP 0.2 μl、抑制剂0.1 μl、RNA 4.5 μl、无水RNase 0.4 μl、RNA引物1.5 μl、RTase 0.5 μl，全过程需在冰浴上操作。反应条件为：16℃ 60 min、42℃ 60 min、85℃ 5 min、4℃循环。

1.6qRT-PCR 配制qRT-PCR 反应体系 2× TaqMAN universal PCR Master混合物10 μl、cDNA 4 μl、无水RNase 5 μl、TaqMAN探针1 μl，总反应体系共20 μl；反应条件为：95℃10 min起始模板预变性，95℃15 s中模板变性、60℃60 s退火循环40次；每个样本均做副管，重复3次，记录实验CT值，取平均值，后经2-△CT转换后进行统计学分析。

1.7统计学方法 采用SPSS17.0及GraphPAD Prism5.0 统计软件进行χ2检验、t检验、Mann-Whitney检验；应用受试者工作特征(ROC)曲线分析计算曲线下面积(AUC)和95%可信区间(CI)；相关性采用Spearman相关分析和多元逐步回归分析。

2 结 果

2.1两组基本资料比较 两组性别、年龄、空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、舒张压(DBP)比较未见显著性差异(P>0.05)。两组总胆固醇(TC)、收缩压(SBP)水平存在显著性差异(P<0.05)(表1)。

表1 两组基本特征

2.2两组血浆miR-9-3p的表达水平 UA组血浆miR-9-3p的表达水平〔0.001 9(0.001 3～0.002 3)〕与对照组〔0.003 2(0.002 5～0.005 7)〕存在显著性差异(U=186.00，P<0.01)。

2.3ROC曲线分析miR-9-3p对UA的诊断价值 AUC为0.88(95%CI，0.80～0.95，P<0.05)，说明miR-9-3p对UA诊断有一定准确性(图1)。

2.4血浆miR-9-3p 表达水平与UA各因素相关性 血浆miR-9-3p与年龄、性别、FPG、TC、TG、HDL-C、SBP、DBP未见显著相关性(r=0.22、-0.19、-0.09、-0.21、-0.21、-0.01、-0.10、-0.04，均P>0.05)，与LDL-C、Gensini评分负相关(r=-0.41、-0.39，均P<0.05)。

图1 ROC曲线分析血浆miR-9-3p对UA 的诊断价值

2.5Gensini评分与血浆miR-9-3p 表达水平相关性 以UA组Gensini评分为因变量，血浆miR-9-3p、年龄、性别、FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、SBP、DBP为自变量进行多元逐步回归分析，Gensini评分与血浆miR-9-3p表达水平呈显著负相关(r=-0.39，P<0.05)。

3 讨 论

miR广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，miR具有较高的稳定性，即使在反复冻融(4～-80℃)、pH改变及DNA和RNA裂解酶等极端条件下也不易降解，能够稳定地存在于细胞及循环系统中〔4〕。同一个体在相同状态下血浆miR表达谱大致相同，在疾病状态下，miR会选择性地从组织细胞释放到外周血中发挥作用或通过血液传递到受体细胞发挥作用〔5〕，这就使得血浆中miR的表达水平发生变化，且血浆中miR变化要早于蛋白类标记物〔6〕，以上特点使血浆miR具有成为一种全新疾病检测标记物的潜能。

目前国际关于miR与CHD研究的报道显示，在CHD发病过程中血浆miR表达水平会发生显著变化，并与冠脉病变严重程度具有相关性，在CHD诊断及病情评估方面起到重要作用。Chen等〔7〕研究显示，与健康人群相比，急性心肌梗死(AMI)患者血浆miR-499表达水平显著升高，并与Gensini评分显著正相关。Wang等〔8〕的研究显示，AMI患者血浆中miR-21-5p与miR-361-5p表达水平显著升高，miR-519e-5p 表达水平显著下降，ROC曲线分析显示以上3种microRNA对AMI均具有一定诊断意义。Ding等〔9〕研究发现CHD患者血浆miR-125b表达水平下降，Gensini评分与miR-125b表达水平负相关。Wang等〔10〕研究显示AMI病人血浆miR-133a表达水平显著升高，ROC曲线分析显示，血浆miR-133a对于CHD的诊断具有较高准确性。还有研究报道显示 CHD 患者较胸痛患者血浆miR-155表达水平显著降低，Spearman相关分析显示其与Gensini评分显著负相关〔11〕。Gensini评分是目前广泛应用于评估CHD病变程度和冠状动脉血管受累范围的指标。

miR-9-3p最初在肿瘤性疾病中研究较多，miR-9-3p在肿瘤形成的病理过程中参与血管新生，目前研究显示miR-9-3p在心血管发育乃至心血管疾病的病理过程中发挥一定作用。研究表明miR-9-3p可以通过靶向抑制心肌细胞血小板衍生生长因子受体-β信号，导致心肌细胞旁分泌血管新生能力显著降低〔12〕。研究表明miR-9-3p的靶向抑制基因包括核因子激活T细胞c3和心肌素，两者是共同构成心肌肥厚的主要因素，miR-9-3p可以通过抑制核因子激活T细胞c3和心肌素的表达，减弱心脏肥大并改善心脏功能〔13〕。研究表明miR-9-3p也可以通过靶向抑制脂肪酰辅酶A(ACAT)的基因表达，调节胆固醇代谢稳态〔3〕，ACAT1的过度表达能够导致细胞内堆积过量胆固醇，促进巨噬细胞向泡沫细胞分化，最终导致动脉粥样硬化〔14〕。研究表明，在衰老的人脐静脉内皮细胞中miR-9-3p表达水平显著升高〔15〕，miR-9-3p能够通过激活磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(AMPK)信号通路促进血管生成〔16〕，以上研究结果均证实血浆miR-9-3p与冠状动脉粥样硬化性疾病密切相关。

综上，UA患者血浆miR-9-3p表达水平显著降低对于UA诊断有一定准确性，且Gensini评分与血浆miR-9-3p表达水平呈负相关。本实验并未阐明miR-9-3p参与CHD形成的具体机制，在今后的研究中应扩大样本量，加入稳定型心绞痛及AMI病例和细胞功能实验，进一步明确miR-9-3p在CHD发病中的作用。