白花鬼针草提取液对小鼠急性酒精性肝损伤保护作用的研究

农生斌 卢红梅

(1.右江民族医学院,广西百色 533000;2.广西农业职业技术学院,广西南宁 530007)

白花鬼针草(Bidens Pilosa L.var.radiata)为菊科鬼针属植物,具有清热解毒、利湿退黄、散瘀活血的效用[1],我国民间上主要用于治疗高血压病、感冒发烧、中暑、消化不良、糖尿病等,还有用于治疗跌打内外伤、胃肠炎、急性黄疸型肝炎等疾病,研究表明,白花鬼针草乙醇乙酯提取物能显著抗癌,抑制结肠癌RKO细胞的增殖及诱导其凋亡[2]。为探讨白花鬼针草提取液对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用,为白花鬼针草进一步开发成为保肝护肝药物提供理论依据,笔者开展白花鬼针草提取液对小鼠急性酒精性肝损伤保护作用的研究,现报道如下。

1 材料与仪器

1.1 仪器

和试剂TDZ4A-WS型台式低速离心机(上海安亭科学仪器厂);TGL-16G型台式低速离心机(上海安亭科学仪器厂);PR0200型匀浆机(江苏金坛市环宇科学仪器厂)。G80D23CSL型微波炉;谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、乙醇脱氢酶(ADH)及总超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(均购于南京建成生物工程研究所)。

1.2 药品

白花鬼针草,经右江民族医学院民族医学教研室覃道光副教授鉴定为真品;56°红星二锅头;海王金樽片。

1.3 实验动物

昆明种SPF级健康雄性小鼠,体重18～22g,许可证编号：SYXK桂2011～0010,由右江民族医学院实验动物中心提供。

2 方法

2.1 白花鬼针草提取液的制备[5]

取适量白花鬼针草全草干品粉碎,按水料比4∶1浸泡40min,盛装于1000ml玻璃烧杯中,加盖微波处理5次,每次30s。微波处理后,用10倍的蒸馏水分2次浸提,每次30min,合并滤液,真空抽滤后浓缩约至每毫升白花鬼针草提取液含生药1g,即1.0g/ml。冰箱冷藏备用。

2.2 小鼠最佳给酒量的筛选[6]

醉酒状态的判断以翻正反射是否消失为指标,小鼠灌酒后,将其背部向下轻放于平板上,若背向下的姿势能够保持30s以上则视为翻正反射消失,即为醉酒。取SPF级雄性小鼠50只,根据随机数字表将小鼠随机分为5组,每组10只小鼠,并以0.12ml/10g、0.13 ml/10g、0.14ml/10g、0.15ml/10g、0.16ml/10g的灌酒剂量随机给5组贴上标签,采用灌胃法给上述各组小鼠相应剂量的红星56°二锅头酒,统计各组醉酒例数和死亡情况,选择致小鼠急性酒精中毒模型所需的最佳给酒量。

2.3 小鼠的分组及给药[7]

取SPF级雄性小鼠84只,体重18～22g,适应性饲养1周后,根据随机数字表分成6个组,正常组、模型组、阳性组(海王金樽1g/ml)及白花鬼针草提取液低剂量、中剂量及高剂量组(分别为0.25g/ml、0.5g/ml及0.75g/ml),每组14只。各组小鼠均按0.1ml/10g的剂量灌胃给予相应药液。除正常组和模型组给予等体积生理盐水外,其余各组分别给予相应剂量药液,每天1次,连续7d。末次给药前禁食不禁水12h后灌胃给予药液,30min后除正常组给予等体积生理盐水外,其余各组均采用2.2.2中最佳给酒量一次性灌胃56°红星二锅头酒。观察小鼠醉酒潜伏期、醉酒率及死亡情况。

2.4 指标检测

于给酒6h后,摘眼球取血,以2500r/min离心15min分离血清备用;小鼠脱臼处死,迅速剖取肝脏,称取肝湿重,取适量肝组织制备10%的组织匀浆,以3500r/min离心15min后取上清液;严格按照试剂盒说明书检测ALT、AST、ADH、SOD、GSH和MDA各项指标。

2.5 统计学方法

应用SPSS17.00软件包进行数据统计分析,各组实验数据均以(±s)表示,各组间的比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验,P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠最佳给酒量的筛选

与其他剂量相比,灌胃0.14ml/10g剂量的56°红星二锅头酒能够得到理想的醉酒例数,同时醉酒潜伏期较短且无死亡现象。故本实验选用0.14ml/10g剂量进行急性酒精中毒实验的最佳给酒剂量(见表1)。

表1 小鼠最佳给酒量的选择

3.2 对醉酒潜伏期、醉酒率、死亡情况的影响

与模型组相比,阳性组、白花鬼针草提取液低、中剂量组均能延长小鼠的醉酒潜伏期,提高小鼠对酒精的耐受能力(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05),但阳性组的效果更为明显;白花鬼针草提取液高剂量组无明显差异但也表现出延长潜伏期的趋势,各组均无死亡例数(见表2)。

3.3 对血清AST、ALT的影响

与正常组相比,模型组的AST、ALT活性增高(P＜0.01,P＜0.05)。与模型组相比,阳性组的AST、ALT具有显著性差异(P＜0.01,P＜0.01),白花鬼针草提取液低剂量的AST、ALT具有显著性差异(P＜0.05,P＜0.05)(见表3)。

表3 白花鬼针草提取液对急性酒精中毒小鼠血清AST、ALT的影响(±s)

表3 白花鬼针草提取液对急性酒精中毒小鼠血清AST、ALT的影响(±s)

注：与正常组相比,∗为P＜0.05,∗∗为P＜0.01;与模型组相比,#为P＜0.05,##为P＜0.01

组别 n ALT(U/L) AST(U/L)正常组 14 42.05±11.23 24.45±5.65模型组 14 52.80±14.42∗ 35.62±9.86∗∗阳性组 14 40.85±9.02## 24.02±6.45##低剂量组 14 44.01±10.79# 28.07±7.55#中剂量组 14 47.10±10.32 29.99±8.97高剂量组 14 48.52±12.91 33.49±7.01

3.4 对肝组织ADH、GSH、SOD、MDA的影响

与正常组相比,模型组GSH含量、ADH、SOD活性均下降(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05),MDA水平升高(P＜0.05)。与模型组相比,阳性组的ADH、GSH、SOD及MDA具有显著性差异(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01),白花鬼针草低、中剂量组的ADH具有显著性差异(P＜0.05,P＜0.05)白花鬼针草低剂量组的GSH具有显著性差异(P＜0.05),白花鬼针草低、中及高剂量组的SOD具有显著性差异(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05),白花鬼针草低、中剂量组的MDA具有显著性差异(P＜0.01,P＜0.05)。与阳性组相比,白花鬼针草中剂量组对肝组织中SOD活性的提高几乎相当;白花鬼针草低剂量组对肝组织中MDA水平的降低优于阳性组(见表4)。

表4 白花鬼针草提取液对急性酒精中毒小鼠肝组织ADH、GSH、SOD、MDA的影响(±s)

表4 白花鬼针草提取液对急性酒精中毒小鼠肝组织ADH、GSH、SOD、MDA的影响(±s)

注：与正常组相比,∗为P＜0.05,∗∗为P＜0.01;与模型组相比,#为P＜0.05,##为P＜0.01

组 别 n ADH(U/ml) GSH(mol/l) SOD(U/ml) MDA(mol/l)正常组 14 4.21±1.32 9.78±3.35 122.80±25.21 4.06±1.15模型组 14 2.89±0.53∗∗ 5.06±1.80∗∗ 104.32±19.38∗ 5.18±1.27∗阳性组 14 4.38±1.20## 9.56±3.15## 129.54±22.46## 3.93±0.94##低剂量组 14 3.88±1.46# 8.51±4.96# 124.95±22.87# 3.97±1.29##中剂量组 14 3.76±1.34# 7.69±2.82 125.72±21.66## 4.12±1.07#高剂量组 14 2.99±0.71 6.73±3.72 121.09±14.45# 4.68±1.28

4 结果与讨论

目前,对于保肝、防治急性酒精中毒的研究,西方国家以合成药物为主,而东方国家以天然植物开发为主[8]。防治急性酒精中毒的机制主要是通过减少酒精吸收,降低血中酒精及相关代谢产物的浓度,减缓对脏器造成的损害[9]。本实验中,阳性组、白花鬼针草提取液低、中剂量组均能延长小鼠的醉酒潜伏期(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05),结果表明三者能够减少酒精的吸收,有效的提高小鼠对酒精的耐受能力,但白花鬼针草提取液的效果不如海王金樽的效果明显。

AST和ALT是存在于肝细胞胞质内重要的转氨酶,主要是用于检测肝功能的常用指标,当肝脏受到损伤出现炎症反应或者坏死时,肝细胞膜破裂后将转氨酶释放入血液,此时血液中的AST和ALT将会升高,其数值表示肝脏损害的程度[10,11]。本实验中,模型组ALT、AST含量显著增高,提示急性酒精中毒小鼠出现肝脏严重损伤的现象,表现为肝功能异常,而与阳性组的AST、ALT与模型组相比具有显著性差异(P＜0.01,P＜0.01),提示阳性组能明显降低血清AST、ALT的活性;白花鬼针草提取液低剂量的AST、ALT与模型组相比具有显著性差异(P＜0.05,P＜0.05),结果表明其能降低血清AST、ALT的活性,能够对抗急性酒精中毒所致的肝脏严重损伤,减轻肝组织损伤所引起的炎症反应或坏死程度,具有一定的改善肝功能的作用;但与阳性组相比,海王金樽片的效果优于白花鬼针草提取液低剂量组的效果。

肝组织内存在乙醇脱氢酶(ADH),是机体内主要参与酒精代谢的酶,吸收后在肝脏代谢的酒精经ADH多次催化氧化后形成中间产物进入三羧酸循环,并以二氧化碳和水的形式排泄[12]。其中经代谢所产生的部分中间产物可损伤肝细胞、影响三羧酸循环以及损伤组织再生修复[13]。因此,通过提高肝细胞内ADH的活性,可加速酒精的代谢,减轻酒精及其代谢过程产生的中间产物对机体脏器所致的伤害。本实验中,模型组ADH活性明显下降(P＜0.01),阳性组、白花鬼针草提取液低、中剂量组ADH活性上升(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05),阳性组的效果更为明显,结果表明在急性酒精中毒状态下,白花鬼针草提取液能够提高肝组织ADH的活性,加速酒精在体内的代谢过程。

过量饮酒后酒精的吸收远大于代谢,大量吸收后的酒精经过循环作用使得机体产生过多自由基,从而对脏器具有损伤的作用[14]。GSH是机体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂,具有整合解毒的作用,通过与自由基等有害物质结合后转化成无害物质。SOD是生物体内重要的酶自由基清除剂,直接反映机体抵抗氧化的水平,有效清除机体内过量的自由基,MDA是活性氧自由基引起的脂质过氧化反应的主要生成物之一,它的含量能够间接表现机体抗氧化能力及清除氧化生成物的能力[15,16]。因此,通过提高机体内SOD活性和增加GSH含量,减少MDA的水平,可以有效地减轻急性酒精中毒引起的脏器损害。本实验中,阳性组和白花鬼针草低、中及高剂量组SOD活性升高(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05),尤以阳性组、中剂量组较为显著;阳性组、白花鬼针草低、中剂量组MDA含量下降(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05),以阳性组和低剂量组效果更佳;阳性组和白花鬼针草低剂量组GSH水平增加(P＜0.01,P＜0.05),结果表明白花鬼针草提取液能促进急性酒精中毒小鼠清除自由基,增强抗氧化的能力,对急性酒精性肝损伤有一定的保护作用。

5 结论

白花鬼针草提取液对小鼠急性酒精性肝损伤有一定的保护作用,可能与提高小鼠对酒精的耐受能力、减轻酒精对肝组织损伤所引起的炎症反应或坏死程度、加快酒精在体内的代谢速度、增强抗氧化能力和清除体内自由基能力有关;究竟是白花鬼针草提取液中的哪些有效成分在发挥作用,有待进一步研究。