降解菌短密木霉对土壤酶活性的影响

刘晴　董爱荣　邓世林　鲍彤　刘薇

摘要：为探究短密木霉以及短密木霉、大豆和咪唑乙烟酸相互作用对土壤蔗糖酶和过氧化氢酶活性的影响，本文采用3，5-二硝基水杨酸法、高锰酸钾滴定法分别测定土壤中蔗糖酶和过氧化氢酶的酶活。结果表明：在土壤中加入短密木霉，5～20 d中土壤蔗糖酶活性均呈现激活趋势，10 d时蔗糖酶活性最高为53.85 mg/kg，激活率达到169.94%;过氧化氢酶活性呈现出激活—抑制—恢复的趋势，5 d时土壤过氧化氢酶活性最高，为2.47 mg/g，激活率达5.71%，随后受到抑制，酶活性最低达2.30 mg/g，抑制率最高达到17.86%。种植大豆、加入短密木霉，再加入100 mg/kg的咪唑乙烟酸后，土壤蔗糖酶活性呈现激活—恢复—激活—抑制的趋势，10 d时土壤蔗糖酶活性最高，为60.09 mg/kg，激活率达201.21%，20 d时蔗糖酶活性被抑制，其活性为68.13 mg/kg，抑制率最高达62.43%;土壤过氧化氢酶活性呈现抑制—恢复—激活的趋势， 20 d时酶活性最低为2.43 mg/g，抑制率最高达到17.98%，40 d时酶活性最高，为2.70 mg/g，激活率最高达到9.46%。

关键词：短密木霉;蔗糖酶; 过氧化氢酶

中图分类号：S158.4文献标识码：A文章编号：1006-8023（2019）03-0009-04

Effects of Trichoderma brevicompactum on Soil Enzyme Activity

LIU Qing1， DENG Airong1*， DENG Shilin1， BAO Tong1， LIU Wei2

（1.College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040; 2.Huludao Forestry Development Service Center， Huludao 125000）

Abstract：In order to investigate the effects of Trichoderma brevicompactum and the interaction of Trichoderma brevicompactum， soybean and imazethapyr on the activities of sucrase and catalase in soil， 3.5-dinitrosalicylic acid method and potassium permanganate titration were used to determine the activities of sucrose and catalase in soil respectively. The results showed that， when Trichoderma brevicompactum was added to the soil， in 5-20 days， sucrase activity showed a trend of activation with the highest activity of 53.85 mg/kg in 10 days and the activation rate of 169.94%. Catalase activity showed a trend of activation-inhibition-recovery. The highest catalase activity was 2.47 mg/g and the activation rate was 5.71%. Then it was inhibited. The lowest catalase activity was 2.30 mg/g and the highest inhibition rate was 17.86%. After planting soybean， adding Trichoderma brevicompactum and 100 mg/kg imazethapyr， soil sucrose activity showed the trend of activation-recovery-activation-inhibition. The highest sucrase activity was 60.09 mg/kg in 10 days， the activation rate was 201.21%， and the sucrase activity was in habited in 20 days with the highest sucrase activity of 68.12 mg/kg and the inhibition rate of 62.43%. Soil catalase activity showed a trend of inhibition-recovery-activation， the lowest activity was 2.43 mg/g in 20 days， the highest inhibition rate was 17.98%， the highest activity was 2.70 mg/g in 40 days， and the highest activation rate was 9.46%.

Keywords：Trichoderma brevicompactum; sucrase; catalase

0引言

土壤酶是土壤生态系统代谢的重要驱动力，土壤中进行化学和生物反应是在酶的催化下进行的。土壤微生物和土壤酶活性变化作为检测土壤质量变化的指标之一，反映了土壤生态系统中微生物参與物质转化和循环的能力，因此土壤酶受到人们越来越多的关注[1-2]。土壤酶参与土壤中所有的生化反应，在物质转化、能量代谢和污染土壤修复等过程中发挥着重要作用[3]。同时土壤酶作为一项生态毒理指标，常用于评价土壤健康及生态环境风险[4]。有研究表明，土壤酶可参与有机化合物的降解，因此，它能在治理污染土壤方面得到应用[5]。重复使用一种或几种类似化学结构的农药，可能导致农药的迅速降解，很快丧失药效，土壤酶参与上述过程，被称为“激活生物降解”[6]。土壤酶降解土壤中的有机化合物的机理，一般认为涉及几个过程：降解、聚合、合成和偶联的酶促反应，形成腐殖质复合体，从而减少土壤中有害有机物的聚积。

咪唑乙烟酸是在1984年由美国氰胺公司开发的咪唑啉酮类除草剂[7]，化学名称为（RS）-5-乙基-2-（4-异丙基-4-甲基-5-1H-2-咪唑啉-2-基）烟酸[8]，该类除草剂具有杀草普广、活性高和选择性强等优点，在农药市场有重要地位[9-10]。咪唑乙烟酸合成抑制剂具有支链型氨基酸，它能阻止乙酞羚酸合成酶，防止蛋白质合成，从而达到除草的目的[11]。咪唑乙烟酸能有效的防除豆科农田里的杂草，与环境的相容性较好[12]。但是咪唑乙烟酸在土壤中的残留时间很长，会对后茬作物造成严重的药害问题[13]，由于咪唑乙烟酸具有长残效性，能造成土壤环境的污染，因此，监测咪唑乙烟酸施用后对土壤酶活性的影响成为评价咪唑乙烟酸生态环境安全性的重要指标。

土壤蔗糖酶可水解蔗糖，反映土壤有机碳转化能力[14]，与土壤中有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，其酶促作用产物直接关系到作物的生长[15]。土壤过氧化氢酶是生物呼吸、生物代谢过程，以及土壤动物、植物根系分泌及残体分解中的重要酶类，与土壤性质关系密切，是较好的土壤微生态环境指示因子[16-17]，其活性可表示土壤氧化过程的强度，并能有效防止土壤及生物体在新陈代谢过程中产生的过氧化氢所造成的毒害[18-19]。

本文分别以土壤蔗糖酶和过氧化氢酶为指标，设计盆栽试验，通过在土壤中添加短密木霉（高效降解菌），明确短密木霉及短密木霉、大豆和咪唑乙烟酸互相作用对土壤酶活性的影响，为应用短密木霉改善土壤生态环境，为修复农药污染土壤的研究提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

盆栽试验土壤为m（草炭）∶m（沙子）∶m（土）=5∶3∶2的比例进行混合所得。大豆品种为黑农48。菌种是课题组前期驯化得到的高效降解菌株短密木霉（Trichoderma brevicompactum）。

培养真菌的培养基采用孟加拉红培养基：蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、琼脂20 g、1/3000孟加拉红溶液100 mL、蒸馏水1 000 mL、氯霉素0.1 g。

保存菌株采用PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g、蒸馏水1000 mL。

1.2盆栽试验

将短密木霉接种于60个PDA平板中，放入培养箱，在温度为25 ℃、黑暗条件下培养5 d。待菌株大量产孢后，将菌丝连同孢子刮下，加入到盛有无菌水的烧杯中，放入少量的吐温80，用玻璃棒充分的搅拌后均匀地混入部分试验用土壤中。再将部分试验用土壤加入5%咪唑乙烟酸水剂，制成咪唑乙烟酸质量分数为100 mg/kg的污染土。选择籽粒饱满、均匀、无病虫的大豆种子，每盆放入15个颗粒，覆土2.0 cm，放在盆栽内自然生长。

以短密木霉为降解菌，按表1设计盆栽试验。试验组在处理后5、10、20、30、40 d分别用五点法取土样，风干，过10目筛，放入冰箱4 ℃保存待用。

1.3酶活性的测定

土壤蔗糖酶活性测定采用3，5-二硝基水杨酸法[20]，过氧化氢酶活性检测采用高锰酸钾滴定法[21]。

土壤酶活性的抑制率（激活率）计算公式为：

抑制率或激活率（%）= [（A-B）/A]×100。

式中：A为空白对照的土壤酶活性;B为不同处理所得的土壤酶活性;结果为正值时表示激活率，为负值时表示抑制率。

1.4数据分析

用Excel2010对数据进行计算;运用SPSS16.0软件进行差异性分析，并采用邓肯方法进行显著性差异分析（P<0.05）;图表中数据为平均值±标准差。

2结果与分析

2.1短密木霉及短密木霉、大豆和咪唑乙烟酸三者相互作用对土壤蔗糖酶活性的影响

由表2可知，在土壤中加入短密木霉后，土壤蔗糖酶活性呈现出激活—恢复—抑制的趋势。在培养期间，A1组与CK组的蔗糖酶活性差异性显著（P<0.05），土壤蔗糖酶活性在5 d时显著高于对照组，开始有显著的激活趋势，到10 d时蔗糖酶活性最高为53.85 mg/kg，激活率达到169.94%，20 d时基本恢复到对照水平，30 d后呈现抑制状态，直到试验结束。

在土壤中种植大豆、加入100 mg/kg的咪唑乙煙酸，再加入短密木霉后，土壤蔗糖酶呈现激活—恢复—激活—抑制的趋势，5 d时蔗糖酶活性与对照组基本持平，在10 d时，活性被激活，土壤蔗糖酶活性为60.09 mg/kg，激活率最高达201.21%，在20 d时，蔗糖酶活性被抑制，蔗糖酶活性为68.13 mg/kg，抑制率最高达62.43%，在30 d，活性逐渐恢复后，在40 d又得到抑制。三者互作后，蔗糖酶活性均与对照组均有显著的差异性（P<0.05）。

2.2短密木霉及短密木霉、大豆和咪唑乙烟酸三者相互作用对土壤过氧化氢酶活性的影响

由表3可知，在土壤中加入短密木霉后，土壤过氧化氢酶活性呈现出激活—抑制—恢复的趋势。在培养期间，与CK组的过氧化氢酶活性均差异性显著（P<0.05）。5 d时显著高于对照组，土壤过氧

化氢酶活性为2.47 mg/g，激活率达5.71%，但到10～20 d时，过氧化氢酶活性得到了抑制，酶活性最低达2.30 mg/g，抑制率最高达到17.86%，30 d时基本恢复到对照水平后又开始出现抑制现象。

在土壤中种植大豆、加入100 mg/kg的咪唑乙烟酸，再加入短密木霉后，土壤过氧化氢酶活性基本呈现抑制—恢复—激活的趋势。5～30 d时土壤过氧化氢酶活性呈现抑制状态，而后恢复至对照水平，并有激活趋势， 20 d时土壤过氧化氢酶活性最低为2.43 mg/g，抑制率最高达到17.98%，40 d时土壤过氧化氢酶活性最高达2.70 mg/g，激活率最高达到9.46%。

3结论与讨论

本研究表明：在土壤中加入短密木霉后，土壤蔗糖酶活性呈现出激活—恢复—抑制的趋势，且与对照组差异显著（P<0.05）。过氧化氢酶活性呈现激活—抑制—恢复的趋势，且与对照组差异显著（P<0.05）。根据课题组前期研究结果，加入短密木霉后，10 d时短密木霉数量最多，其后占比逐渐下降，且土壤中的真菌总数量恢复到对照水平[22]。上述结果与短密木霉在土壤中的数量变化有直接关系。这与陈建爱等[23]的研究结果基本一致，黃绿木霉T1010制剂处理日光温室番茄连作土壤，可有效提高土壤酶活性，改善土壤生态环境。

在土壤中种植大豆、加入短密木霉，再加入100 mg/kg的咪唑乙烟酸三者相互作用后，土壤蔗糖酶活性呈现激活—恢复—激活—抑制的趋势，土壤过氧化氢酶活性呈现抑制—恢复—激活的趋势，且两种土壤酶活性均与对照组有一定的差异性（P<0.05）。

【参考文献】

[1]GARCIAGIL J C， PLAZA C， SOLERROVIRA P， et al. Long-term effects of municipal solid waste compost application on soil enzyme activities and microbial biomass[J]. Soil Biology and Biochemmistry， 2000， 32（13）： 1907-1913.

[2]BURGER M， JACKSON L E. Microbial immobilization of ammonium and nitrate in relation to ammonification and nitrification rates inorganic and conventional cropping systems[J]. Soil Biology and Biochemistry， 2003， 35（1）： 29-36.

[3]张莉莉，陈利军，刘桂芬，等.污染土壤的酶学修复研究进展[J].应用生态学报，2003，14（12）：2342-2346

ZHANG L L， CHEN L J， LIU G F， et al. Advance in enzymological remediation of polluted soils[J]. Chinese Journal of Applied Ecology， 2003， 14（12）： 2342-2346.

[4]崔荟萍，赵桂琴，刘欢.除草剂对燕麦田土壤脲酶和碱性磷酸酶活性的影响[J].中国草地学报，2014，36（1）：37-43.

CUI H P， ZHAO G Q， LIU H. Effects of herbicide on the activities of urease and alkaline phosp hatase in oat field[J]. Chinese Journal of Grassland， 2014， 36（1）： 37-43.

[5]莫晶，闫文德，刘曙光，等.油茶-花生间作土壤酶活性与养分的关系[J].中南林业科技大学学报，2017，37（6）：89-95.

MO J， YAN W D， LIU S G， et al. Soil enzyme activities and their relations with soil fertility in Camellia oleifera peanut intercropping[J]. Journal of Central South University of Forest & Technology， 2017， 37（6）： 89-95.

[6]曾巧云，莫测辉，蔡全英.农业土壤中邻苯二甲酸酯的污染现状与危害[J].广东农业科学，2009，45（7）：90-92.

ZENG Q Y， MO C H， CAI Q Y. Current situation and harmfulness of phthalic acid esters in agricultural soil[J]. Guangdong Agricultural Sciences， 2009， 45（7）： 90-92.

[7]程志明，顾保权.咪唑啉酮类除草剂──咪草烟的合成[J].农药，2001，40（9）：9-12.

CHENG Z M， GU B Q. The synthesis of herbicides imazethapyr[J]. Agrochemicals， 2001， 40（9）： 9-12.

[8]史史伟.咪唑乙烟酸对土壤微生物、酶活性的影响及其降解真菌的筛选[D].北京：中国农业科学院， 2010.

SHI W. Effects of imazethapyr on soil microorganism， enzyme activity and isolation of imazethapyr degrading fungi[D]. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2010.

[9]PERUCCI P， SCARPONI L. Effects of the herbicide imazethapyr on soil microbial biomass and various soil enzyme activities[J]. Biology and Fertility of Soils， 1994， 17（3）： 237-240.

[10]张昌朋，刘新刚，徐军，等.咪唑乙烟酸对土壤微生物生态的影响[J].农药，2010，49（2）：117-119.

ZHANG C P， LIU X G， XU J， et al. Effect of imazethapyr on soil microbial ecology[J]. Agrochemicals， 2010， 49（2）： 117-119.

[11]刘维屏，郑巍，宣日成，等.除草剂咪草烟在土壤上吸附-脱附过程及作用机理[J].土壤学报，1998，35（4）：475-481.

LIU W P， ZHENG W， XUAN R C， et al. Adsorption-desorption process and interaction mechanism of herbicide imazethapyr with soils[J]. Acta Pedologica Sinica， 1998， 35（4）： 475-481.

[12]唐庆红，张一宾.除草剂咪草烟的合成方法探讨[J].上海化工，1998，23（13）：31-33.

TANG Q H， ZHANG Y B. The method for synthesizing imazethapyr[J]. Shanghai Chemical Industry， 1998， 23（13）： 31-33.

[13]孙建光，姜瑞波，任天志，等.我国农田和水体污染及微生物修复前景[J].中国农业资源与区划，2008，29（1）：41-47.

SUN J G， JIANG R B， REN T Z， et al. Prospect for farmland and water pollution and microorganism repair in China[J]. Chinese Journal of Agricultural Resources and Regional Planning， 2008， 29（1）： 41-47.

[14]范昆，王开运，王东，等.1，3-二氯丙烯对土壤脲酶和蔗糖酶活性的影响[J].农药学学报，2006，8（2）：139-142.

FAN K， WANG K Y， WANG D， et al. The effect of 1， 3-dichloropropene on activities of soil urease and invertase[J]. Chinese Journal of Pesticide Science， 2006， 8（2）： 139-142.

[15]曹慧，孙辉，杨浩，等.土壤酶活性及其对土壤质量的指示研究进展[J].应用与环境生物学报.2003，9（1）：105-109.

CAO H， SUN H， YANG H， et al. A review soil enzyme activity and its indication for soil quality[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology， 2003， 9（1）： 105-109.

[16]BANDICK A K， DICK R P. Field management effects on soil enzyme activities[J]. Soil Biology and Biochemistry， 1999， 31（11）： 1471-1479.

[17]ZIMMERMANN S， FREY B. Soil respiration and microbial properties in an acid forest soil： effects of wood ash[J]. Soil Biology and Biochemistry， 2002， 34（11）： 1727-1737.

[18]劉昌玲，王国庆.细菌过氧化氢酶的分离、结晶及性质[J].生物化学与生物物理进展，1990，17（5）：380-383.

LIU C L， WANG G Q. Isolation， crystallization and properties of bacterial catalase[J]. Progress in Biochemistry and Biophysics， 1990， 17（5）： 380-383.

[19]黄永洪，花慧，沈国强，等.猪肝过氧化氢酶提取条件的研究[J].生物技术通讯，2005，16（1）：40-42.

HUANG Y H， HUA H， SHEN G Q， et al. Study on extraction of catalase from pig liver[J]. Letters in Biotechnology， 2005， 16（1）： 40-42.

[20]关松荫.土壤酶及其研究法[M].北京：农业出版社，1986.

GUAN S Y. Soil enzymes and its methodlog[M]. Beijing： Agricultural Press， 1986.

[21]周礼恺.土壤酶学[M].北京：科学出版社， 1987.

ZHOU L K. Soil enzymology[M]. Beijing： Science Press， 1987.

[22]李志国，霍璐阳，刘宇彤，等.短密木霉、大豆和咪唑乙烟酸对土壤真菌多样性及农药残留的影响[J].东北林业大学学报.2018，46（3）：87-91.

LI Z G， HUO L Y， LIU Y T， et al. Effects of Trichoderma brevicompactun， soybean， and imazethapr on soil fungal diversity and pesticide residues[J]. Journal of Northeast Forestry University， 2018， 46（3）： 87-91.

[23]陈建爱，陈为京，杨焕明，等.黄绿木霉T1010对日光温室耕层土壤酶活性的调控效应[J].天津农业科学.2013，19（1）：20-23.

CHEN J A， CHEN W J， YANG H M， et al. Regulating effect of Trichoderma aureoviride 1010 on enzyme activity in the solar-greenhouse soil[J]. Tianjin Agricultural Sciences， 2013， 19（1）： 20-23.