鱼腥草芩蓝口服液质量控制方法研究

邢玉娟，王建国，刘升，李灵娟，刘运镇，邱树磊

(1.江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300；2.山东省威海市环翠区动物疫病预防控制中心，山东威海 264200；3.河南牧翔动物药业有限公司，郑州 451162)

鱼腥草芩蓝口服液由鱼腥草、黄芩、金银花、连翘、板蓝根组成，具有清热解毒功效，临床上常用于治疗外感风热引起的发热、咽喉疼痛、急性咽炎、扁桃腺炎等症[1]。试验表明其具有良好的抗炎、镇痛作用[2]，近年来，将其开发成新兽药[3]，用于治疗鸡感冒发热，对于鸡因外邪入侵引起的体温升高、呼吸道感染等症状有明显的改善作用，且应用安全[4]，具有很好的市场前景。研究采用TLC法对鱼腥草芩蓝口服液中的鱼腥草、黄芩、连翘和金银花进行鉴别，采用HPLC法测定黄芩苷和绿原酸的含量，为全面控制该制剂的质量提供了准确可靠的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent Technologies-1260型高效液相色谱仪，紫外可变波长检测器，安捷伦色谱数据工作站；薄层色谱数码相机成像系统，GoodSee-20E，上海科哲生化科技有限公司；酸度计，PHS-3C，上海精密科学仪器有限公司。

1.2 试药 鱼腥草芩蓝口服液，由河南牧翔动物药业有限公司提供，批号：20160801、20160802、20160803。鱼腥草对照药材，批号121046-200403；连翘苷对照品，批号110821-201213；绿原酸对照品，批号110753-201314；黄芩苷对照品，批号110715-201318；以上均购自中国食品药品检定研究院。硅胶G板、聚酰胺薄膜；双蒸馏水；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 鱼腥草 取本品20 mL，用5%氢氧化钠溶液调节pH值至11-12，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取鱼腥草对照药材2 g，加水50 mL，加热回流30 min，滤过，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验[5]，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮(15∶1)为展开剂，展开，取出，晾干 ，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果见图1，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

2.1.2 黄芩 取本品5 mL，加乙醇10 mL，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验[5]，吸取上述两种溶液5 μL，分别点于同一以4%醋酸钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液。结果见图2，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2.1.3 连翘 取本品10 mL，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，加在中性氧化铝柱(100～200目，6 g，内径1 cm)上，用70%乙醇50 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取连翘苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验[5]，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果见图3，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2.1.4 金银花 取本品2 mL，加水20 mL，用稀盐酸调节pH值至2，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验[5]，吸取上述两种溶液各1 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果见图4，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

S:鱼腥草对照药材；Y:阴性对照；1-3:鱼腥草芩蓝口服液S: the control of Houttuynia cordata; Y: negative control;1-3: Yuxingcao Qinlan oral liquid图1 鱼腥草TLC图Fig 1 TLC diagram of Houttuynia cordata

S:黄芩苷对照品；Y:阴性对照；1-3:鱼腥草芩蓝口服液S: baicalin control; Y: negative control;1-3: Yuxingcao Qinlan oral liquid图2 黄芩TLC图Fig 2 TLC map of Scutellaria baicalensis

S:连翘苷对照品;Y:阴性对照:1-3:鱼腥草芩蓝口服液S: Fructus forsythoside control; Y: negative control;1～3: Yuxingcao Qinlan baicalen oral liquid图3 连翘TLC图Fig 3 TLC diagram of fructus forsythiae

S:绿原酸对照品;Y:阴性对照;1-3:鱼腥草芩蓝口服液S: Chlorogenic acid as a control product; Y: negative control;1-3: Yuxingcao Qinlan oral liquid图4 金银花TLC图Fig 4 TLC diagram of honeysuckle

2.2 黄芩苷含量测定[6-7]

2.2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填冲剂；以甲醇-0.6%磷酸溶液(47∶53)为流动相；检测波长为278 nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2000。采用此色谱条件，流出的曲线基线稳定、分离度高，重复性好，因此本品采用此色谱条件进行含量测定。

2.2.2 对照品溶液的制备 取黄芩苷对照品适量，精密称定28.31 mg(含量为93.3%)，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取本品2 mL，置250 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理20 min，放置至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 专属性试验 依据处方中的比例，按制法制备缺黄芩的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液，在选定的色谱条件下，同时取对照品溶液、供试品溶液、缺黄芩的阴性对照溶液进样。结果供试品溶液色谱中与对照品溶液在相同的保留时间内有相似的黄芩苷色谱峰，而阴性对照溶液无此峰，说明鱼腥草芩蓝口服液的其它成分对黄芩苷的测定无干扰(图5A-C)。

A 黄芩苷对照品HPLC图 HPLC diagram of baicalin controlB 供试品HPLC图 Test product HPLC diagramC缺黄芩阴性样品HPLC图 HPLC map of negative scutellaria图5 鱼腥草芩蓝口服液中黄芩苷的HPLC图Fig 5 HPLC diagram of Baicalin in Yuxingcao Qinlan oral liquid

2.2.5 线性关系试验 精密量取对照品贮备溶液适量，用甲醇稀释制成浓度为含黄芩苷分别为10.57、26.41、52.83、105.65、132.06、264.13 μg/mL的系列对照品溶液，摇匀，在选定的色谱条件下，进样10 μL，记录各色谱峰峰面积；以进样浓度(X，μg/mL)与峰面积均值(Y，mAu)绘制标准曲线，得黄芩苷回归方程Y=33.42325X-214.6128，相关系数r=0.9997。结果表明，黄芩苷进样量在0.1057～2.6413 μg范围内与峰面积有良好的线性关系。

2.2.6 精密度试验 取同一浓度的黄芩苷对照品溶液，在选定色谱条件下，连续进样6次，记录黄芩苷峰面积，平均峰面积为1862.17，其RSD为0.87%。结果表明，仪器精密度良好。

2.2.7 重复性试验 取同一批供试品(批号：20160802)，按供试品溶液制备方法，制备6份样品，在选定的色谱条件下，测定峰面积并计算含量。结果黄芩苷平均含量为6.03 mg/mL，RSD为0.15%，表明重复性良好。

2.2.8 稳定性试验 取供试品(批号：20160801)，按照供试品溶液制备方法配制溶液，在选定的色谱条件下，分别于0、2、4、8、12 h测定，测定峰面积并计算含量。结果黄芩苷平均含量为6.22 mg/mL，RSD为0.09%，表明供试品溶液中黄芩苷在12 h内保持稳定。

2.2.9 加样回收率试验 精密称取黄芩苷对照品(含量为93.3%)65.59 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度备用。精密量取已知含量(6.22 mg/mL)的鱼腥草芩蓝口服液(批号为：20160801)1 mL，置250 mL量瓶中，精密加入上述对照品溶液10 mL，加甲醇适量，超声处理20 min，放置至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按上述方法，制备供试品溶液6份，在选定色谱条件下，测定黄芩苷含量并计算回收率。结果黄芩苷的加样回收率在98.03%～99.67%，平均值为98.74%，RSD为0.70%，表明回收率良好。

2.2.10 黄芩苷含量限度测定 取连续批次生产的鱼腥草芩蓝口服液10批，按供试品溶液制备方法处理，取10 μL进样，记录峰面积并计算含量。结果黄芩苷平均含量为6.32 mg/mL，根据产品测定结果，结合加速稳定性试验结果，暂定本品中每1 mL含黄芩按黄芩苷(C21H18O11)计，不得少于4.50 mg。

2.3 绿原酸含量测定[8-10]

2.3.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水-冰醋酸(20∶80∶1)为流动相，检测波长324 nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000。采用此色谱条件，流出的曲线基线稳定、分离度高，重复性好，因此本品采用此色谱条件进行含量测定。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密量取本品10 mL，置100 mL棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 对照品溶液的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加水制成每1 mL含40 μg的溶液，即得。

2.3.4 缺金银花阴性对照溶液的制备 依据处方中的比例，按制法制备缺金银花阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.3.5 绿原酸专属性试验 在选定的色谱条件下，同时取对照品溶液、供试品溶液、上述阴性样品溶液，注入液相色谱仪。结果表明，供试品溶液主峰的保留时间与绿原酸对照品溶液主峰的保留时间一致，缺金银花的阴性样品溶液略有干扰；缺金银花和连翘的阴性样品溶液略有干扰；但是缺金银花和鱼腥草的阴性样品溶液无干扰；缺鱼腥草金银花连翘阴性样品溶液无干扰(图6D-H)。

D绿原酸对照品HPLC图 HPLC diagram of chlorogenic acid as a control productE供试品HPLC图 Test product HPLC diagramF缺金银花阴性HPLC图 Negative HPLC diagram of honeysuckleG缺金银花和连翘阴性HPLC图 Negative HPLC diagram of honeysuckle and forsythia forsythiaH缺金银花和鱼腥草阴性HPLC图 Negative HPLC diagram of honeysuckle and houttuyniaI缺金银花、鱼腥草和连翘HPLC图 HPLC map of honeysuckle, houttuynia cordata and forsythia forsythia图6 鱼腥草芩蓝口服液中绿原酸的HPLC图Fig 6 HPLC diagram of chlorogenic in Yuxingcao Qinlan oral liquid

由试验可知，处方中的绿原酸归属为金银花约占(802.5-43.5)/802.5=94.6%，鱼腥草占(43.5-39.7)/802.5=4.7%，连翘所占绿原酸含量极低忽略不计。绿原酸的归属为金银花和鱼腥草(表1)。

2.3.6 绿原酸线性关系试验 精密量取绿原酸对照品储备液适量，用水稀释成浓度为绿原酸分别为4.10、8.20、16.41、41.02、82.04、205.10 μg/mL，摇匀。在选定的色谱条件下，进样10 μL，记录各色谱峰峰面积；峰面积为纵坐标，以峰面积(Y，mAu)对浓度(X，μg/mL)进行线性回归，绘制标准曲线，得绿原酸回归方程为：Y=-86.78088+27.5937X，相关系数r=0.9995，回归显著。结果表明，绿原酸进样量在0.041～2.051 μg/mL 范围内与峰面积有良好的线性关系。

表1 专属性色谱图信息Tab 1 Specific chromatographic information

2.3.7 绿原酸精密度试验 取同一浓度绿原酸对照品溶液，在选定的色谱条件下，进样量10 μL，分别平行进样6次，记录绿原酸峰面积，平均峰面积为934.5438，RSD为0.4%，表明所用仪器精密度良好。

2.3.8 绿原酸重复性试验 取同一批供试品(批号：20160905)，按供试品溶液制备方法，制备6份样品，在选定的色谱条件下，进样量10 μL，测定峰面积并计算含量。结果绿原酸平均含量为0.4 mg/mL，RSD为1.3%，表明重复性良好。

2.3.9 绿原酸日间稳定性试验 取供试品(批号：20160905)，按供试品溶液制备方法，在选定的色谱条件下，进样量10 μL，分别在0、2、4、6、8 h测定，结果平均含量为0.4 mg/mL，RSD为1.8%，制备的供试品溶液中绿原酸在8 h内保持稳定。

2.3.10 绿原酸加样回收率试验 鱼腥草芩蓝口服液批号为20160905，绿原酸含量为0.41 mg/mL，精密量取供试品5 mL，置100 mL量瓶中，加水适量，加入绿原酸对照品(含量为96.2%)，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按上述方法，制备供试品溶液6份，在选定的色谱条件下，测定绿原酸含量并计算回收率。结果绿原酸的加样回收率在98.41%～99.45%，平均值为99.08%，RSD为0.42%，表明回收率良好。

2.3.11 绿原酸含量限度测定 取连续批次生产的鱼腥草芩蓝口服液10批，按供试品溶液制备方法处理，取10 μL进样，记录峰面积并计算含量。结果绿原酸平均含量为0.41 mg/mL，根据产品测定结果，结合加速稳定性试验结果，每1 mL含金银花、鱼腥草以绿原酸(C16H18O9)计，不得少于0.20 mg。

3 讨论与结论

3.1 TLC鉴别方法的选择 研究采用TLC法对鱼腥草芩蓝口服液中的鱼腥草、黄芩、连翘和金银花进行了定性分析，通过方法筛选结果[5，11-12]，釆用该鉴别方法简单易行，具有分离度好、重复性好、专属性强的特点，能清晰的看到鱼腥草、黄芩、连翘和金银花的特征性显色斑点，专属性较强，阴性无干扰。

3.2 HPLC定量检测时色谱条件的选择 研究对检测波长进行了比较。通过全波长扫描显示，黄芩苷在315和278 nm都有波峰吸收，但在278 nm处具有最大吸收，故选择278 nm为黄芩苷的检测波长；绿原酸在217和324 nm都有波峰吸收，但在324 nm处最大吸收，故选择324 nm为绿原酸的检测波长[13]。

在流动相的选择上，黄芩苷实验中考察了甲醇-水(1∶1)、甲醇-0.6%磷酸溶液(47∶53)为流动相，结果显示前者黄芩苷色谱峰峰型不符合测定要求，故选甲醇-0.6%磷酸溶液(47∶53)作为流动相[14]；绿原酸实验中考察了甲醇-水-冰醋酸(20∶80∶1)为流动相，采用此色谱条件，流出的曲线基线稳定、分离度高，重复性好，因此本品采用此色谱条件进行含量测定。

3.3 超声提取时间的考察 为了最大限度的提取药液中的有效成分，本研究对超声时间进行了考察。黄芩苷供试品不超声和超声10、20、30 min，黄芩苷含量分别为5.89、5.90、6.06、6.06 mg/mL，超声20 min即可提取充分；绿原酸供试品在不超声和超声10、20、30 min，绿原酸含量标准偏差为0.5%，含量差别不明显[15]。

3.4 绿原酸的归属考察 试验表明，供试品溶液主峰的保留时间与绿原酸对照品溶液主峰的保留时间一致，缺金银花阴性溶液的绿原酸峰面积占供试品溶液绿原酸峰面积为5.4%；缺金银花和连翘阴性溶液的绿原酸峰面积占供试品溶液绿原酸峰面积为4.7%；缺金银花和鱼腥草阴性溶液的绿原酸峰极小未积分；缺鱼腥草、金银花和连翘阴性溶液在绿原酸对照品色谱峰的保留时间处，无干扰，专属性强，不影响产品质量控制，方法学符合要求。由试验可知，处方中的绿原酸归属为金银花约占94.6%，鱼腥草约占4.7%，连翘所占绿原酸含量极低忽略不计。绿原酸的归属为金银花和鱼腥草，这和陆安等人的研究结果一致[16-18]。

鱼腥草芩蓝口服液的成分复杂，为了在生产中能保证药品质量，研究选择用薄层色谱法对鱼腥草、黄芩、连翘和金银花进行定性鉴别。采用高效液相色谱法测定鱼腥草芩蓝口服液中黄芩苷和绿原酸的含量，暂定本品中每1 mL含黄芩按黄芩苷(C21H18O11)计，不得少于4.50 mg；每1 mL含金银花、鱼腥草以绿原酸(C16H18O9)计，不得少于0.20 mg。