ABCG2 mRNA的表达与乳腺癌蒽环类药物化疗效果的关系研究

徐象威 朱佩祯 张鹏海 陈银巧 奚一源

乳腺癌是女性发病率最高且具有高度特异性、侵袭性的恶性肿瘤。2012年统计数据显示，全球有近170万女性被诊断为乳腺癌[1]。我国尚处于乳腺癌低发地区，是全球乳腺癌发病率最高国家（比利时）的 1/6，但自1998至2007年我国乳腺癌发病率增长1.2～2.8倍，且在过去30年中我国乳腺癌死亡率也增长了近1倍[2]。化疗对于延长乳腺癌尤其是晚期乳腺癌患者生存时间具有重要意义。蒽环类药物是乳腺癌化疗中最常用的药物，但由于个体的差异性，不同患者对蒽环类药物的敏感性与耐药性不同，临床疗效亦不同[3]。近年来肿瘤个体化治疗成为医学界关注的热点，如能预测患者对蒽环类药物化疗的敏感性，选择合适的化疗方案，或可提高肿瘤治疗的临床效果。研究发现，三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2（ABCG2）与肿瘤化疗耐药、放疗抵抗、激素治疗不敏感等存在明显关系[4-5]。ABCG2是多数化疗药物（拓扑异构酶抑制剂、蒽环类、喜树碱类似物、酪氨酸激酶抑制剂及抗代谢药物）的底物，可加速药物从细胞内泵出，降低肿瘤细胞中有效药物浓度[6]。基于此，本研究通过分析乳腺癌患者蒽环类药物化疗前后ABCG2 mRNA的表达情况，探讨其与化疗效果的关系，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2012年6月至2013年12月本院肿瘤内科收治的乳腺癌根治术后接受蒽环类药物化疗的患者60例。纳入标准：（1）经手术与病理学检查确诊为乳腺癌浸润性导管癌者，经 CT、MRI证实具有1处或1处以上可测量的肿瘤病灶，根据国际抗癌联盟TNM分期进行分期；（2）心电图和（或）左心室射血分数（LVEF）测定评分达标；（3）患者肝肾功能检查正常，均能达到化疗的基本要求，患者的身体状况评分（ECOG评分）0～2分；（4）预计生存期＞3个月，功能状态评分（KPS评分）≥60分；（5）初始治疗方案为以蒽环类药物为主的联合化疗，且至少化疗4个周期。排除标准：（1）合并2种及以上原发恶性肿瘤；（2）妊娠期女性；（3）存在严重内分泌代谢及免疫疾病者。60例患者均为女性；其中年龄＞45岁36例，≤45岁24例；处于绝经状态33例，未绝经状态27例；临床分期Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ期21例，Ⅳ期14例；一般健康状况评分（PS评分）0～1分 25例，2分35例。本研究经永康市第一人民医院医学伦理会审查且批准，患者均签署书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 化疗方法与疗效评判 患者入院后均给予标准的含蒽环类药物联合化疗方案。包括：多西他赛/多柔比星/环磷酰胺（TAC）、多柔比星/环磷酰胺（AC）、多西他赛/环磷酰胺（TC）等。患者接受4个周期化疗后，通过肿瘤标志物、B超、胸部CT或MRI等检查评判化疗效果。疗效评判标准参照实体肿瘤疗效评判标准[7]，分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、无变化（SD）、疾病进展（PD）。有效率=[（CR+PR）/（CR+PR+SD+PD）] ×100%，稳定率=[（CR+PR+SD）/（CR+PR+SD+PD）] ×100%。根据肿瘤对含蒽环类药物联合化疗的反应，将患者分为化疗高反应患者与化疗低反应患者。患者表现为经蒽环类药物化疗后呈CR或PR视为高反应，而化疗后SD或PD视为低反应。

1.2.2 ABCG2 mRNA表达水平检测 （1）样本采集：采集患者初次化疗前、化疗4个周期后的肘静脉血5ml，标注患者信息与采血时间。（2）采用RNAprep pure血液总RNA提取试剂盒（天根生化有限公司，批号：Q5704）提取总RNA，严格按照试剂盒说明书进行操作。（3）将提取出的总RNA通过逆转录试剂盒（Thermo Fermentas公司，批号：00314956）合成cDNA产物，置于-20℃保存待测。（4）取上述所获得的cDNA，采用实时定量逆转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）检测化疗前后ABCG2 mRNA表达水平。提取出的cDNA通过引物（上游：5′-GCGCAAGCTTATGTCTTCCAGTAATGTCGAA-3′；下游：5′-GCGCTCTAGATTAAGGGGAAATTTAAGAATA-3′）扩增目的基因。此后按照KAPA SYBR®FAST Real-time PCR Ki（tKAPA公司，批号：KK4601）的反应体系加入试剂在ABI 7300 qPCR仪进行实时荧光定量完成ABCG2 mRNA表达水平检测。以β-actin为内参，采用相对定量法（ΔΔCt）对实时荧光定量PCR产物进行比较。ΔCt=Ct均值（目的基因）-Ct均值（管家基因）；ΔΔCt=实验组ΔCt-对照组 ΔCt；以 2-ΔΔCt计算 mRNA 表达水平的差异。

1.2.3 预后情况观察 患者均进行为期5年的随访，主要通过电话随访、门诊或住院病历系统查询等方式，统计预后情况。主要观察终点为疾病无进展生存，疾病无进展生存期指自首次化疗后至随访终止或疾病复发或转移的时间，主要通过医院信息系统或患者直系亲属电话确认，末次随访时间截止2018年12月。患者在化疗疗程结束后每2个月随访1次以评估生存期。

1.3 观察指标 （1）观察患者化疗效果；（2）比较化疗高反应患者与化疗低反应患者临床特征，包括年龄、月经状况、临床分期、PS评分等；（3）比较化疗高反应患者与化疗低反应患者化疗前后ABCG2 mRNA表达水平；（4）分析乳腺癌患者化疗后ABCG2 mRNA表达水平与疾病无进展生存期的关系。以患者化疗后ABCG2 mRNA表达水平中位数为界，分为ABCG2 mRNA高表达（表达水平≥中位数）患者与低表达（表达水平＜中位数）患者，比较ABCG2 mRNA高表达患者与低表达患者疾病无进展期。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件；计量资料以表示，两组比较采用两独立样本t检验，组内化疗前后比较采用配对t检验；计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法绘制疾病无进展生存曲线，疾病无进展生存期的比较采用Wilcoxon秩和检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者化疗效果 60例患者经过4个周期的化疗后，CR 9例，PR 28例，SD 18例，PD 5例；治疗有效率为61.7%，稳定率为91.7%。化疗高反应患者37例、低反应患者23例。

2.2 化疗高反应患者与化疗低反应患者临床特征比较 见表1。

表1 化疗高反应患者与化疗低反应患者临床特征比较[例（%）]

由表1可见，化疗高反应患者与化疗低反应患者年龄、月经状况、临床分期、PS评分等比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.3 化疗高反应患者与化疗低反应患者化疗前后ABCG2 mRNA表达水平比较 见表2。

表2 化疗高反应患者与化疗低反应患者化疗前后ABCG2 mRNA表达水平比较

由表2可见，组间比较，化疗前，化疗高反应患者与化疗低反应患者ABCG2 mRNA表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；化疗后，化疗后高反应患者ABCG2 mRNA表达水平低于化疗低反应患者（P＜0.05）。组内比较，化疗高反应患者化疗后ABCG2 mRNA低于化疗前（P＜0.05），而化疗低反应患者化疗后ABCG2 mRNA表达水平高于化疗前（P＜0.05）。

2.4 乳腺癌患者化疗后ABCG2 mRNA表达水平与疾病无进展生存期的关系分析 本研究60例患者化疗后ABCG2 mRNA表达水平中位数为1.24，ABCG2 mRNA高表达（表达水平≥1.24）患者与低表达（表达水平＜1.24）患者疾病无进展生存曲线见图1。

由图1可见，ABCG2 mRNA高表达患者与低表达患者中位疾病无进展生存期分别为47个月与54个月，ABCG2 mRNA低表达患者疾病无进展生存期长于高表达患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 ABCG2 mRNA高表达患者与低表达患者疾病无进展生存曲线比较

3 讨论

蒽环类药物作为乳腺癌化疗方案中最常用的药物之一，无论在乳腺癌术前新辅助治疗、复发转移解救治疗还是在晚期乳腺癌辅助治疗中都有非常重要的作用。但肿瘤细胞对产生化疗药物耐受性是影响化疗效果及患者预后的首要原因，约90%的转移性乳腺癌患者化疗失败归咎于多药耐药（MDR）。研究认为，ABC转运体在乳腺癌细胞中的过度表达是造成MDR最常见的一种机制[8]。ABCG2是ABC超家族中ABC-G亚家族的第2个成员，因其首先在乳腺癌耐药株（MCF-7/AdrVp）中被发现，亦称为乳腺癌耐药蛋白（BCRP）[9]。ABCG2/BCRP是一种ATP依赖性转运体，以同源或异源二聚体来发挥ATP依赖性药物外排转运体的作用，利用ATP水解产生的能量降低细胞内药物或内源性及外源性细胞毒药物浓度，产生特殊的药物耐药性[10]。

当前有研究报道称，在乳腺浸润性导管癌、食管癌、纤维肉瘤和多发性骨髓瘤等的耐药细胞株中ABCG2均存在过度表达，ABCG2蛋白在乳腺癌组织中阳性表达率、表达水平均明显高于癌旁组织[11-12]。Qu等[13]研究发现，与化疗前相比，化疗后的残存乳腺癌细胞膜上ABCG2呈高表达，这说明化疗后乳腺耐药相关蛋白的表达上调。王飞通等[14]发现，SW1990细胞经过吉西他滨处理后，增殖能力明显受抑制，呈时间依赖性减弱，而SW1990细胞中ABCG2蛋白与mRNA的表达成时间依赖性的升高，表明吉西他滨诱导ABCG2基因表达上调是造成肿瘤细胞逃避细胞毒药物杀伤的机制之一。本研究结果显示，化疗高反应患者ABCG2 mRNA表达水平均较化疗前降低，而化疗低反应患者较化疗前升高。这说明乳腺癌化疗效果与患者ABCG2 mRNA表达水平呈负相关。这与Marzac等[15]的研究结果相似，其对急性髓细胞白血病患者规范化疗后的随访发现，患者高表达ABCG2与完全缓解率、耐药率和总生存率有显著的相关性。分析可能原因，肿瘤患者化疗后ABCG2基因的表达上调，当达到一定程度时发挥外排泵功能，将进入细胞内的化疗药物逆浓度梯度的转运到细胞膜外，从而降低细胞内药物浓度，促使一些肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性，从而影响化疗效果。

ABCG2的表达与患者预后的关系研究已有报道。Ota等[16]发现经铂类药物化疗的非小细胞肺癌患者的生存期较短，这与ABCG2的过表达有关，多因素分析显示ABCG2的表达是影响疾病无进展生存期的独立因素。何建明等[17]发现，三阴性乳腺癌ABCG2阳性表达患者的生存期与累计生存率均明显低于ABCG2阴性者，ABCG2阳性表达率越高，其预后越差。本研究结果显示，ABCG2 mRNA表达水平与乳腺癌患者疾病无进展生存期有关，ABCG2 mRNA低表达患者疾病无进展生存期高于高表达患者；且化疗高反应患者疾病无进展生存期亦长于化疗低反应患者。

综上所述，乳腺癌患者接受蒽环类药物化疗后，ABCG2 mRNA低表达患者其外排蒽环类药物能力弱于高表达的患者，可使肿瘤细胞内药物保持在有效治疗浓度，患者化疗效果较好，且疾病无进展生存时间较长，预后较好。蒽环类药物可诱导乳腺癌患者ABCG2 mRNA表达的改变，检测其表达水平对于判断乳腺癌患者化疗效果与预后具有一定的参考价值。