应用GeneXpert法检测沈阳地区某医院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌耐药基因的研究

侯博研 张智洁 周秀珍 王虹 陈愉中国医科大学附属盛京医院呼吸与危重症医学科，沈阳 0004；中国医科大学附属盛京医院检验科，沈阳 0004；中国医科大学第七临床学院 辽宁省健康产业集团抚矿总医院呼吸科，抚顺 000

肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae，KP)属革兰阴性杆菌，是一种条件致病菌，常存在于人体上呼吸道和肠道。肺炎克雷伯菌引起的医院感染率近期逐年增高，已成为医院及社区获得性感染的重要病原菌之一[1-2]。碳青霉烯类抗菌药物是针对革兰阴性菌的广谱β-内酰胺类抗菌药物，曾被认为是自20世纪80年代来对抗多药耐药革兰阴性菌的最后一道防线。随着临床广谱抗菌药物的过度应用，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯杆菌(Carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP)的出现，导致临床几近无药可用，患者治疗费用增加，病死率增加，给临床抗感染治疗提出了巨大困难和挑战[3-5]。肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的机制中关注度最高的因素为携带产碳青霉烯酶耐药基因。本研究对北方地区CRKP对常见抗菌药物的耐药性及5种耐药基因进行了检测分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2013年1月至2017年6月盛京医院微生物室从不同病区各种临床标本培养出的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌60株，标本类型包括：血液痰、尿液、导管末端、穿刺液、胸水等。剔除同一患者重复菌株。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.2 试剂和仪器 肠杆菌科药敏板卡；美罗培南、亚胺培南、厄他培南药敏纸片(温州市康泰生物科技有限公司)；哥伦比亚血琼脂培养基(梅里埃生物制品有限公司)；MH平板(梅里埃生物制品有限公司)；Xpert Carba-R试剂盒(GXCARBARCE-10美国赛佩公司)；Vitek 2细菌全自动鉴定仪(法国生物梅里埃公司)；Gene-Xpert XVI-4-2检测仪(808400美国赛佩公司)；生物安全柜(海尔公司)；细菌培养箱(Thermo公司)；比浊仪(法国生物梅里埃公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 VITEK 2 Compact法细菌鉴定和药敏分析

(1)菌株复苏：三区划线法将保存菌株在血平板上，细菌培养箱35℃孵育16～24 h；(2)在载卡架上放试管，每管中加入3 ml NaCl溶液；(3)配制比浊浓度0.5麦氏单位的菌悬液； (4)取145μl上述菌悬液与3 ml 0.45%NaCl混合，震荡混匀；(5)将药敏板卡放在卡架上，卡片输样管插入到菌悬液中，启动检测；(6)读取结果。

1.3.2 扩散法(Kirby-Bauer纸片扩散法)药敏实验 (1)菌株复苏(同上)；(2)配制比浊浓度0.5麦氏单位的菌悬液；(3)用无菌棉签蘸取菌液，挤压去除多余菌液后均匀涂抹于MH培养基上，切换角度分别涂抹3次，最后沿培养基内缘均匀涂抹一周并盖上盖子；(4)置室温干燥3～5 min后用镊子将药敏拭子贴于培养基面上；(5)培养箱孵育18～24 h；(6)量取抑菌环直径，判读结果。

1.3.3 GeneXpert法检测耐药基因 (1)菌株复苏(同上)；(2)在载卡架上放一次性塑料试管，每管中加入3 ml生理盐水；(3)配制比浊浓度0.5麦氏单位的菌悬液；(4)吸取10μl至样本处理液，漩涡震荡10 s；(5)吸取约1.7 ml混合液加入试剂盒内，盖上试剂盒盖子启动检测；(6)判读结果。

1.4 判定及排除标准 (1)耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌判定标准[6]：根据美国临床实验室标准委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2016年版标准(CLSIMl00-S26)，抑菌圈直径：厄他培南≤18 mm、亚胺培南和美罗培南≤19 mm判断为耐药或VITEK-2药敏显示这三种抗生素中介、耐药，需进行手工法确认。对亚胺培南、美罗培南或厄他培南中至少一种耐药的菌株为耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌；(2)排除标准：剔除重复标本。

1.5 统计学分析 应用SPSS 23.0软件进行统计学分析，各组间率的比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌对常见抗菌药物的药敏结果 我院分离的60株CRKP对常用的16种抗生素药敏结果显示(表1)：阿米卡星敏感度最高达78.95%；左氧氟沙星及环丙沙星敏感率分别为48.28%和43.10%；氨基糖苷类中的庆大霉素和妥布霉素、磺胺类中的复方新诺明敏感率分别37.93%、35.71%及29.31%；呋喃妥因敏感率为5.26%，中介率为28.95%；青霉素类、β-内酰胺酶抑制剂、头孢类以及其他β-内酰胺类中的氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢替坦、头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢唑林、氨苄西林/舒巴坦敏感率0%～15.52%。

表1 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌对常见抗菌药物的药敏结果

2.2 CRKP耐药基因检测结果 收集我院60株CRKP应用GeneXpert方法检测5种耐药基因结果显示(表2、3)：携带碳青霉烯酶49株，占81.67%；其中，携带KPC酶30株，占50%；携带NDM酶28株，占46.67%；携带IMP-1酶3株，占5%；未携带碳青霉烯酶11株，占18.33%。携带单一KPC酶19株，占31.7%；携带单一NDM酶18株，占30%；携带单一IMP-1酶1株，占1.7%；同时携带KPC和NDM酶9株，占15%；同时携带KPC和IMP-1酶1株，占1.7%；同时携带IMP-1、KPC和NDM酶1株，占1.7%；其余型耐药基因未检出。

2.3 是否检出耐药基因与亚胺培南药物最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)分析结果 亚胺培南药物敏感性MIC值与是否检出耐药基因差异存在统计学意义(表4)，检出耐药基因菌株对亚胺培南耐药更严重。

2.4 检出耐药基因数与患者预后分析结果 检出耐药基因数量与患者预后差异无统计学意义(表5)，未检出耐药基因临床菌株、检出1种耐药基因临床菌株及检出2种及以上耐药基因临床菌株对患者病情好转及痊愈或死亡及病情加重退院差异无统计学意义。

表2 60株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌菌株各耐药基因检出数量

表3 60株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌菌株耐药基因检出情况

表4 是否检出耐药基因与亚胺培南药物敏感性MIC值分析

表5 检出耐药基因情况与患者预后分析(株)

3 讨论

碳青霉烯类抗菌药物在国内外均有广泛应用，常用的碳青霉烯类包括有：亚胺培南(泰能)、厄他培南(怡万之)、美罗培南(美平)、比阿培南等。CRKP由Mack-enzie等于1997年在美国北卡罗莱纳州首次发现，此菌能够水解并产生碳青霉烯酶[7]。之后陆续在国内外出现报道，并且大多数表现快速增长的趋势。近年耐碳青霉烯类肠杆菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE)的检出率呈逐年升高趋势，Marsik和Nambiar[8]报道，CRE分离率2008年为0.6%，2016年上升至6.4%。

本研究中，该菌对抗感染治疗常用的16种抗生素中氨基糖苷类中的阿米卡星敏感性最高达78.95%，临床可选择作为治疗药物，但单药治疗常难以控制感染。喹诺酮类中左氧氟沙星及环丙沙星敏感率分别为48.28%和43.10%，也可作为仅次于阿米卡星用于控制该菌感染的第二选择。氨基糖苷类中的庆大霉素和妥布霉素、磺胺类中的复方新诺明敏感率分别37.93%、35.71%及29.31%，不适合用于控制沈阳地区CRKP的感染。呋喃妥因敏感率为5.26%，中介率为28.95%，亦不适合用于控制该菌的感染。青霉素类、β-内酰胺酶抑制剂、头孢类以及其他β-内酰胺类中的氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢替坦、头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢唑林、氨苄西林/舒巴坦敏感率在0%～15.52%。在临床治疗中，应根据抗菌谱、抗生素的效能及药敏结果，遵循耐药率由低到高的原则选择耐药率小于30%的抗菌药物以降低耐药现象的出现。可以看出，我院分离出CRKP菌株对常见抗菌药物的耐药情况不容乐观，β-内酰胺类抗生素是治疗肠杆菌科细菌感染的有效抗菌药物，但随着产β-内酰胺酶的肠杆菌科细菌广泛出现，此类抗菌药物的抗感染治疗作用明显下降。并且，研究发现某些种类的β-内酰胺类抗生素对肠杆菌科细菌存在接种效应。接种效应是指在细菌的接种浓度增高100倍时，抗菌药物的最低MIC值至少升高8倍的现象，这种程度不同的接种效应导致很多β-内酰胺类药物即使体外药敏试验结果敏感也不推荐于临床应用。据文献报道，部分感染致病菌不仅对β-内酰胺类耐药率高，而且呈现出多重耐药现象，有少部分CRKP菌株对阿米卡星、喹诺酮类敏感，这些药物可以联合应用治疗CRKP[9]。研究显示，多黏菌素对耐碳青霉烯类肠杆菌CRE有相对较好的体外抗菌活性，可选择作为治疗药物[9-10]。早期文献报道多黏菌素可产生肾毒性及神经毒性，曾因此在国内临床应用逐渐减少。近年来国内外研究人员对多黏菌素进行了更深入的研究，之前的报道中由于研究对象差异大、缺少对照研究、给药量不同等而对多黏菌素不良反应的估计存在一定程度的夸大，并且多药耐药的革兰阴性杆菌的迅速增多并且常导致严重感染，使黏菌素再次受到关注。替加环素对多重耐药的革兰阴性杆菌抗菌效果好，是目前为数不多对CRE有抗菌作用的高效的广谱抗菌药物之一[11]。联合用药能提高治疗效果并有利于预防细菌耐药性的产生。

虽然肠杆菌科细菌耐药机制多为携带产酶耐药基因，但耐药基因的流行和分布情况在不同种属细菌中存在差异。Ambler分类法根据氨基酸序列的相似性把β-内酰胺酶分为4类(A、B、C、D)，其中A类、B类、D类中存在能水解碳青霉烯类的酶，因此被称为碳青霉烯酶[12-13]。A类中最具有代表意义的酶型是肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemases，KPC)，也是最具有临床意义的酶型，属于典型的非金属碳青霉烯酶。早年携带KPC酶耐药基因是肺炎克雷伯杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药最常见的机制。KPC耐药基因可经整合子、质粒与插入序列基因原件进行传播，存在局部爆发的潜在威胁[14]。澳大利亚2012年报道了第1例临床分离产KPC酶KP，该患者感染前曾去过希腊[15]。法国Meaux医疗中心曾报道过产KPC酶在KP中出现小范围的流行，经MLST分型实验结果均为ST512型，之后证实与一例意大利感染患者有关[16]。之后诊断这类细菌感染的患者中也多有在其他国家旅行的经历[17]。携带KPC耐药基因的KP与感染患者在不同国家之间的旅行传播有密切关系。我国于2007年初次发现产KPC酶的KP[18]。B类碳青霉烯酶比较常见的酶型有IPM型及VIM型。近年报道新发现的新德里金属β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase，NDM)也属于B类酶。2007年末印度籍瑞典男性在新德里地区某医院手术后并发感染，于2008年初回到瑞典。该患者在住院期间，分别注射了加替沙星、阿莫西林克拉维酸、阿米卡星、甲硝唑等药物。2008年1月，在该患者尿液中分离到的KP进行研究发现一种新型金属β-内酰胺酶，此株细菌对绝大多数抗生素耐药。经英国Cardiff大学的Timothy R Walsh教授团队分析，是一种金属β-内酰胺酶，被命名为NDM-1型[19]。NDM-1酶对碳青霉烯类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类等抗生素有耐药性。目前，携带NDM耐药基因菌的感染已经从印度、巴基斯坦等国家传播到英国、美国、德国、法国、澳大利亚、加拿大、西班牙、比利时、日本、荷兰国家[20-23]。D类碳青霉烯酶一般在肠杆菌科细菌中较少见。KPC型碳青霉烯酶是导致肠杆菌出现耐药性的关键，其原因可能是头孢菌素酶的表达强度过大，造成其与外膜孔蛋白的合并发生丢失，因此大大降低了碳青霉烯类抗生素与青霉素结合蛋白结合能力，使得碳青霉烯类抗菌素水解而产生β-内酰胺酶，最终导致耐药菌的产生[24]。产NDM菌一半以上分离自印度，可通过质粒在细菌间自由移动、复制和传播，可在细菌之间传递，近几年在我国呈逐年增多趋势，散发分布且波及菌种较多，主要在华东地区报道较多，已报道的有大肠埃希菌、克雷伯菌属、不动杆菌属等[25]。上海一项研究报道，2010～2013年从上海新华医院临床样本中分离到CRKP77株，其中69株携带KPC基因，占90%。经测序为KPC-2基因，这些菌株可能通过患者院内转科形成播散[26]。广州市一项研究报道，南方医科大学附属广州军区广州总医院分离2015年26株CRKP，经PCR检测结果25株携带KPC酶，1株携带IMP酶，未检测出OXA-48、VIM、NDM酶[27]。

本研究中显示，沈阳地区60株CRKP携带碳青霉烯酶49株；以携带KPC及NDM酶型为主，偶见携带IMP-1酶型，其余耐药基因型未检出。本次实验检出耐药基因型与我国南方地区报道存在差异，可能存在地域差异导致耐药基因检出不同以及随时间推移耐药基因型别分布发生变化等。关于两种或两种以上碳青霉烯酶在同一菌株中分离的报道也越来越多。2012年印度首次分离到一株同时携带KPC和NDM基因的KP[28]。KP中发现的耐药基因类型也逐年增多，这些耐药基因主要存在细菌的质粒中，通过细菌与细菌之间的传播进而导致医院感染及流行。此次实验中检测常见五种基因型(KPC、NDM、IMP-1、OXA-48、VIM)，这样无法排除是否存在其他类型耐药基因，并且未检出耐药基因的CRKP菌株可能存在例如外排泵等其他的耐药机制。Tzouvelekis等[29]研究报道在15项研究中50例碳青霉烯类单药治疗的CRE感染，碳青霉烯类药物MIC＞8 mg/L时碳青霉烯类治疗失败率高达75%。本实验发现检出耐药基因临床菌株对亚胺培南药物敏感性MIC≥16 mg/L与未检出耐药基因临床菌株差异有统计学意义。怀疑细菌感染的患者，应尽早留取标本行药物敏感性及耐药基因检测。

本实验中应用的GeneXpert仪器是全自动一体化的半巢式荧光PCR检测系统，该系统将PCR样品制备和检测程序设定于一体，对样品完全自动化地进行核酸提取、纯化、扩增与检测，应用即时的光学检测软件，一旦发现目标基因便可以得出结果，极大地减少了检测所需时间。GeneXpert系统全程检测均在封闭试剂盒中全自动进行，确保结果准确可靠。从患者标本采集至送检及结果回报可在2 h内完成，可以及时指导临床医生调整治疗方案降低治疗失败率。本研究通过收集临床资料分析，检出耐药基因数量与患者预后差异无统计学意义，此结果可能与患者存在其他基础疾病等影响因素、药物敏感性结果回报时间、临床抗菌药物应用及机体的差异性有关。据报道，感染CRE的患者或CRE无症状携带者有有可能成为感染源[30]。产NDM酶细菌可能主要会从危重患者、插管和机械通气患者和老年人等易感人群身上分离出来，甚至引起院内传播[31]。加强医护人员手卫生、遵守操作规范、加强消毒隔离措施，减少院内感染的发生，争取做到早发现、早隔离、早诊断、早治疗。同时开展相关调查研究，及时了解这类菌株耐药现状、流行趋势及特点。CRKP已经引起世界范围关注，所以实验室及临床上应给予此类细菌监测足够的重视，以防CRKP耐药菌株暴发流行。