茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠NF-κB、iNOS及TNF-α的影响研究*

马浩轩 田光敏 刘 鹏△ 彭 琴 王 绒 钟庭燕

（1.西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000；2.四川省自贡市第四人民医院，四川 自贡643000）

急性肝衰竭是发展迅速的严重肝脏疾病，可由多种病因引起，临床上以严重肝功能损伤、凝血功能异常、肝性脑病等为主要表现［1]。目前尚缺乏有效治疗手段，人工肝、西医综合治疗等疗效欠佳。肝脏移植可从根源上治疗急性肝衰竭，但因供肝来源稀少、手术昂贵及术后排异反应等限制了肝脏移植的广泛应用［2-3]。现有研究表明［4]，急性肝衰竭的主要病理机制为肝脏内环境紊乱，炎症因子释放致内毒素血症形成，肝细胞大量凋亡坏死，导致肝脏功能急剧恶化，预后极差。治疗关键点在于控制促炎因子生成、减轻肝脏炎症、改善内毒素血症环境、减少肝细胞死亡。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是来源于骨髓的多能干细胞，因其具有多向分化潜能、易于培养、修复增殖能力突出等优点而受到青睐［5]。 已有研究发现［6]，BMSCs 与肝细胞具有一定同源性，其不仅具有提升免疫及抗纤维化能力［6-7]，还具有炎症调节、抑制细胞凋亡等作用［7-8]。基于上述发现，BMSCs已逐步成为再生医学及细胞领域研究的重点与热点，不少学者已将其应用于终末器官衰竭的研究中，以期取得更好的治疗效果。

急性肝衰竭在中医内科学中可归属“鼓胀”“积聚”“急黄”等范畴，总的病机可归纳为湿热邪毒交结致瘀血内阻、热瘀搏结。临证以清热解毒、凉血化瘀为其基本治法，茵陈四苓颗粒为代表方剂。茵陈四苓颗粒为西南医科大学附属中医医院肝病科孙同郊教授经验方所成，前期研究发现，肝衰竭体外环境下，茵陈四苓颗粒含药血清可提高BMSCs的肝向分化及免疫调节能力［9]，但具体机制未做深入探讨。本实验就茵陈四苓颗粒联合BMSCs移植治疗急性肝衰竭大鼠，从炎症通路及相关促炎因子的转录方面进一步探索中药联合干细胞治疗急性肝衰竭大鼠的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SPF级SD大鼠10只，2～3周龄，体质量100～120 g，作干细胞分离用。健康雄性SD 清洁级大鼠 60 只，6～8周龄，体质量 180～200 g，用于动物实验。动物由西南医科大学动物实验中心提供，动物生产许可证号：SCXY （川）2008-17，使用许可证号：SCXY（川）2008-065。

1.2 试药与仪器 1）试药：茵陈四苓颗粒（组成：茵陈、栀子、大黄、白公翁、茯苓、白术等，西南医科大学附属中医医院制剂室制备，川药制字Z20070525，许可证号：川20160039HZ）；复方甘草酸苷片（日本米诺发源制药株式会社，规格25 mg/片，国药准字J20130077，批号 16027）。 2）硫代乙酰胺（TAA）（北京化学试剂公司）；L-DMEM 培养基、胎牛血清（Hyclone 公司）；NF-κB单克隆抗体 （Abcam公司）；SABC免疫组化染色、DAB、PCR试剂盒 （Roche公司）；RT-PCR引物设计（上海生工）。2）仪器：CO2培养箱（3111系列直热式，美国 Thermo）；-80℃超低温冰箱（Thermo991，美国热电）；医用低速离心机（白洋400c，北京白洋）；荧光定量 PCR 仪（Realplex2，德国 eppendorf）；凝胶扫描成像系统（GelDocXR，美国伯乐公司）。

1.3 大鼠BMSCs的分离、纯化与体外培养大鼠置于操作台，予以脱颈处死。将大鼠浸泡于75%酒精中消毒。后转移至超净工作台，全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs。剪去大鼠双侧腿骨，剥净皮毛及肌肉筋膜，剪去两端骨骺，予以细胞培养基反复快速冲洗骨髓腔，无菌条件下收集干细胞悬液，调整细胞浓度至1.0×106个/mL，静置细胞培养箱中孵育培养（37℃，5%CO2）。每隔2 d全量换液，观察记录细胞形态。每于细胞铺满皿底约90%面积时予以胰酶消化传代。传至P3代时，细胞呈旋涡状紧密排列，经流式细胞仪鉴定后备用。

1.4 模型制备 将大鼠随机分为6组，包括正常组、模型组、阳性对照组、中药组、干细胞组、联合组。大鼠自由进食饮水，适应性喂养1周后用于造模。造模前12 h禁食不禁水，采用硫代乙酰胺（TAA）400 mg/kg灌胃，间隔24 h重复1次，制备急性肝衰竭模型，正常组予以等量生理盐水灌胃。观察大鼠精神状态、毛发色泽、进食水量、体质量等变化。造模后模型组大鼠血清ALT、AST水平较正常组明显升高，肝组织病理染色提示急性肝损伤表现，肝细胞坏死、凋亡，大量炎症细胞浸润，肝小叶结构破坏，表明成功完成急性肝衰竭模型制备。

1.5 给药方法 将5 g茵陈四苓颗粒溶于20 mL蒸馏水中，调整质量浓度为250 mg/mL。按照标准体质量动物间药物剂量换算将复方甘草酸苷片配置成质量浓度为23 mg/kg的溶液常温备用。造模成功后中药组及联合组予以茵陈四苓颗粒1.5 g/kg灌胃，每天2次，阳性对照组予以复方甘草酸苷片23 mg/kg灌胃，其余各组等量生理盐水灌胃；干细胞组及联合组尾静脉注射干细胞悬液1.0×106个/mL，其余各组尾静脉注射等体积（1.2 mL）细胞培养基。

1.6 标本采集及检测 干预72 h后，大鼠麻醉后开腹，腹主动脉采血，右肝相近部位取肝组织，部分予以4%多聚甲醛固定，进行后续病理观察及核因子-κB（NF-κB）免疫组化检测，部分置于冻存管内，用于iNOS及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）检测。 1）生化指标检测：腹主动脉采血后离心，经全自动生化分析仪检测血清AST、ALT及血浆内毒素（ET）水平。2）肝脏病理观察：肝组织经4%多聚甲醛固定48 h后，常规包埋、切片、脱蜡、HE染色、脱水、石蜡封片，光镜下观察各组大鼠肝组织病理变化。3）SABC免疫组化法检测肝组织中NF-κB的表达。按说明书步骤进行，山羊血清常温封闭20 min后滴加一抗，4℃过夜，PBS清洗后加入二抗（生物素标记羊抗兔抗体），37℃温箱中放置30 min，清洗后滴加SABC，温箱静置后DAB显色，后经脱水、透明、封片、晾干等处理。切片经Image-Pro Plus 6.0进行平均光密度值检测，积分光密度（IOD）值表示NF-κB表达强度。阳性表现：细胞染呈棕黄色，定位于细胞核和（或）细胞质。4）RT-PCR检测肝组织中TNF-α及iNOS基因表达。按照RNA抽提试剂盒说明书方法提取总RNA后进行逆转录，合成cDNA。取cDNA产物2 μL，反应体系为 20 μL，扩增条件为：95 ℃预变性5 min，95℃变性 15s，60℃［TNF-α]，58℃［iNOS]退火15 s，72℃延伸30 s，扩增40个循环，以GAPDH作为内参作数据分析。引物设计根据GenBank公布的基因序列，设计合成均由上海生工完成。见表1。

表1

1.7 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间均数比较采用方差分析（ANOVA）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清AST、ALT及血浆ET水平比较见表2。72 h后各组AST、ALT及血浆ET水平明显低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.01），但各治疗组大鼠血清AST、ALT及ET水平较正常组仍高 （P＜0.01）。联合组肝功能损伤程度及ET水平最低，与其他治疗组比较，差异显著（P＜0.01），其余各治疗组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠血清AST、ALT及血浆ET比较（±s）

表2 各组大鼠血清AST、ALT及血浆ET比较（±s）

与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与联合组比较，▲P＜0.01。下同

组 别 n ET（EU/mL）正常组 10 0.097±0.01模型组 4 0.59±0.01*阳性对照组 5 0.41±0.01*△▲ALT（U/L） AST（U/L）55.20±6.36 71.30±7.50 747.75±20.78* 779.75±12.79*381.20±15.90*△▲ 398.80±19.08*△▲中药组 5 0.39±0.01*△▲389.20±14.04*△▲ 416.20±14.82*△▲干细胞组 6 383.67±13.74*△▲ 406.67±13.95*△▲ 0.40±0.02*△▲联合组 7 281.00±15.86*△ 276.71±13.07*△ 0.20±0.01*△

2.2 各组大鼠肝脏病理组织观察结果 见图1。干预72 h后模型组大鼠肝小叶结构紊乱，肝细胞弥漫坏死，肝索破坏，炎性细胞浸润明显；72 h后各治疗组肝小叶结构较模型组有所恢复，肝细胞坏死程度减轻，可见部分增生肝细胞，炎性浸润减轻，其中联合组损伤程度最轻。

图1 各组大鼠肝脏病理组织观察结果（HE染色，400倍）

2.3 各组大鼠肝组织NF-κB表达水平比较 见表3，图2。正常组肝组织中存在少量NF-κB表达。相较于正常组，其余各组表达NF-κB的细胞数量明显增加（P＜0.01）。干预72 h后，各治疗组NF-κB表达水平明显低于模型组（P＜0.01）。但与正常组比较，NF-κB表达仍高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。各治疗组间相比，NF-κB表达水平以联合组降低最为显著（P＜0.05），其余治疗组间表达程度无明显差异（P＞0.05）。

表3 各组大鼠肝组织NF-κB免疫组化表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠肝组织NF-κB免疫组化表达水平比较（±s）

组 别 n正常组 10模型组 4阳性对照组 5 NF-κB 172.40±6.65 292.00±11.60*245.80±8.53*△▲中药组 5 240.40±5.08*△▲干细胞组 6 237.83±5.04*△▲联合组 7 207.00±7.12*△

图2 各组大鼠肝组织NF-κB免疫组化结果（DAB染色）

2.4 各组大鼠TNF-α、iNOS基因转录水平比较 见表4，图3。正常组肝组织中存在少量TNF-α、iNOS基因转录。干预72 h后，与正常组相比，其余各组TNF-α、iNOS基因转录水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，各治疗组中TNF-α、iNOS的基因转录水平均明显降低，且差异显著（P＜0.01）；各治疗组间比较，以联合组基因转录水平降低最为显著（P＜0.05），其余治疗组间差异比较无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组大鼠肝组织中TNF-α、iNOS的基因转录水平比较（±s）

表4 各组大鼠肝组织中TNF-α、iNOS的基因转录水平比较（±s）

组 别 n正常组 10模型组 4阳性对照组 5中药组 5干细胞组 6联合组 7 TNF-α iNOS 1.01±0.17 1.00±0.11 3.18±0.20* 5.99±0.86*2.65±0.34*△▲ 4.13±0.36*△▲2.60±0.28*△▲ 3.93±0.64*△▲2.31±0.40*△▲ 3.53±0.95*△▲1.49±0.12*△ 1.80±0.24*△

图3 各组大鼠肝组织PCR电泳结果

3 讨 论

研究发现［10]，急性肝衰竭导致肝细胞大量坏死，内环境紊乱促进各种炎症因子释放，致内毒素血症形成是其早期主要的病理机制。其治疗重点在于减少细胞坏死及炎症因子，减轻肝脏炎症反应，避免加重内毒素血症。

NF-κB是介导细胞内炎症反应最重要的通路之一，活化后的NF-κB诱导大量炎症因子的合成，引起炎症过度化与重症化［11-12]。肝衰竭发生时，其下游炎症因子如TNF-α、iNOS、IL-1等大量合成释放，加重肝脏损伤，且进一步促进NF-κB的激活，形成恶性循环，最终导致肝内爆发性炎症失控，使肝脏合成、代谢及解毒功能发生严重障碍［13]。当TNF-α大量分泌时，诱导产生内毒素血症，可对肝细胞造成严重损伤［5，14]。且TNF-α不仅介导炎症反应，其还可与FAS死亡受体结合，激活凋亡起始物Caspase-8，进而诱导细胞凋亡［15]。当受到内毒素、TNF-α等刺激后，iNOS表达迅速升高，通过干扰肝脏生物转化及线粒体毒性、损伤DNA、诱导肝细胞凋亡等途径参与肝脏炎症损伤［16]。

由于干细胞在细胞修复、再生方面具有独特的优势，且骨髓来源的干细胞具有免疫原性低，易于获得和培养等优点，目前已将其应用于急慢性肝病的治疗，干细胞不仅能够提高爆发性肝衰竭的生存率，还可以促进受损肝细胞增殖，抑制肝细胞凋亡［6-7]。

茵陈四苓颗粒为本院自制，由四川省名老中医孙同郊教授经验方所成。方中重用茵陈为君，取其清热利湿退黄之功，大黄、赤芍为臣药，凉血化瘀，佐以茯苓、白术补中健脾，全方以清泄为主，攻补兼施，共奏清热解毒化瘀扶正之效。临床研究显示，茵陈四苓颗粒在治疗重型肝炎中表现出改善肝功能、提高凝血酶原活动度等功效［17]，动物实验证实［18]，茵陈四苓颗粒明显降低急性肝损伤大鼠的转氨酶及血浆ET水平，表明其在调节重肝大鼠炎症反应方面有一定作用。

本实验通过TAA灌胃成功建立急性肝衰竭大鼠模型，通过复方甘草酸苷片、茵陈四苓颗粒、单纯干细胞和茵陈四苓颗粒联合干细胞等治疗方法，发现各治疗组均能有效降低AST、ALT及血浆ET水平，且联合组效果优于其他治疗组。为进一步探索相关机制，本实验测定了炎症信号通路NF-κB的表达及其下游炎性因子TNF-α、iNOS的基因转录。结果证明单纯中药治疗、干细胞干预、二者联合治疗均能降低NF-κB的表达、减少TNF-α、iNOS的基因转录，有效控制肝内失控性炎症反应、保护肝脏功能。联合组疗效优于各单纯治疗组，表明茵陈四苓颗粒联合干细胞治疗可能通过介导炎症通路、清除内毒素及炎性介质等作用，促进干细胞的分泌，增强干细胞的修复增殖及抗凋亡能力。清热解毒凉血化瘀切中急性肝衰竭的主要病理环节，以其为治疗大法而成的茵陈四苓颗粒可以为干细胞治疗急性肝衰竭提供新的联合手段，二者联合亦可为急性肝衰竭的治疗提供新的思路。