沙生蜡菊总黄酮最佳提取工艺的研究

李怡玮， 王 莹， 兰 卫,3

(新疆医科大学1中医学院， 乌鲁木齐 830011； 2附属中医医院药学部， 乌鲁木齐 830002; 3新疆名医名方与特色方剂学实验室， 乌鲁木齐 830011)

沙生蜡菊[Helichrysumarenarium(L)Moench.]为菊科蜡菊属植物的全草，主要分布于我国新疆阿勒泰、青河、布尔津等地区[1],具有降糖、降脂、利尿、抗氧化等功效，临床上多用于胆囊炎、急慢性肾炎的治疗[2-8],其中主要的化学成分为黄酮类和多酚类化合物[9-11]。研究发现沙生蜡菊黄酮类成分主要有山柰酚、槲皮素、芹菜素、柚皮素、木犀草素、蒙花苷、柯伊利素等，其中槲皮素含量较高且具有代表性[12-16]。本研究以乙醇浓度、料液比和提取时间为考察因素，以槲皮素为对照品，通过单因素实验和正交实验确定沙生蜡菊中总黄酮的最佳提取工艺，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司),DK-S24型电热恒温水浴锅 (上海精宏实验设备有限公司),SHB-III型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司),UV2550型紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司),DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，EYELA SB-1000型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)。

1.2 试剂槲皮素(购自上海源叶生物科技有限公司，批号C20J6Y1722)，无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，批号20180203)，亚硝酸钠(天津市化学试剂三厂，批号20171115)，硝酸铝(天津市福晨化学试剂厂，批号20180120)，氢氧化钠(天津市盛奥化学试剂有限公司，批号20170314)，以上试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。

1.3 药材沙生蜡菊2017年4月采集于新疆阿勒泰地区，经新疆医科大学中医学院中药资源教研室主任盛萍教授鉴定确认为菊科蜡菊属植物沙生蜡菊[Helichrysumarenarium(L)Moench]的干燥全草。

2 方法与结果

2.1 总黄酮的含量测定

2.1.1 标准品溶液的制备 称取槲皮素标准品2.14 mg于25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，备用，得0.085 6 mg/mL槲皮素标准品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 称取沙生蜡菊药材2.0 g置于圆底烧瓶中，用80%乙醇溶液，温度75℃，料液比为1∶15，提取2次，每次1 h，后取1 mL上清液于100 mL容量瓶中，蒸馏水定容，摇匀，即得供试品溶液。

2.1.3 回归方程的建立 分别吸取“2.1.1”项下槲皮素标准品溶液1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中，用蒸馏水补足至5 mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL摇匀，反应6 min，加10%硝酸铝溶液0.3 mL摇匀，反应6 min，再加入4%氢氧化钠溶液3 mL摇匀，最后用70%乙醇定容，反应15 min，于375 nm处测量其吸光度A(空白对照为只有显色剂无槲皮素标准品)，取3次吸光度平均值。以槲皮素标准品为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(Y)轴，得回归方程式为Y=14.558X+0.003 8，r=0.999 3，槲皮素浓度范围在0.008 6～0.042 8 mg/mL内线性关系良好。

2.1.4 精密度实验 吸取“2.1.2”项下供试品溶液5 mL，按“2.1.3”项下方法操作，测定375 nm处吸光度A，连续测定6次，结果RSD=0.7%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性实验 吸取“2.1.2”项下供试品溶液5 mL，按“2.1.3”项下方法操作，测定375 nm处吸光度A。在180 min内，每隔30 min测定1次，计算相对标准偏差，结果RSD=0.9%(n=6)，表明供试品溶液在3 h内稳定性良好。

2.1.6 重复性实验 按“2.1.2”项下方法重复提取供试品溶液6次，按“2.1.3”项下方法操作，测定375 nm处吸光度A，RSD=0.8%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.1.7 加样回收实验 吸取已知总黄酮含量的供试品溶液5 mL，共6份，分别加入槲皮素标准溶液1 mL，摇匀，按照“2.1.3”项下方法进行显色反应后，测定375 nm处吸光度A。结果平均回收率为96.61%，RSD=0.9%(n=6)，表明方法加样回收率良好。

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇浓度对沙生蜡菊黄酮提取含量的影响 称取6份沙生蜡菊药材，每份2.0 g置于圆底烧瓶中，分别加入0%、20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液，温度75℃，料液比1∶15，提取2次，每次1 h，取1 mL上清液于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，按“2.1.3”项下方法测定，计算总黄酮含量。当乙醇浓度为60%时，沙生蜡菊总黄酮含量最高，故选则60%乙醇溶液为最佳提取溶液,见表1。

表1 乙醇浓度对沙生蜡菊黄酮提取含量的影响

2.2.2 料液比对沙生蜡菊黄酮提取含量的影响 称取6份沙生蜡菊药材，每份2.0 g置于圆底烧瓶中，按照料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35加入60%乙醇，温度75℃，提取2次，每次1 h,取1 mL上清液于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，按“2.1.3”项下方法测定，计算总黄酮含量。当料液比为1∶20时，沙生蜡菊总黄酮含量最高，故选则1∶20为其最优料液比，见表2。

表2 料液比对沙生蜡菊黄酮提取含量的影响

2.2.3 提取时间对沙生蜡菊黄酮提取含量的影响 称取6份沙生蜡菊药材，每份2.0 g置于圆底烧瓶中，料液比为1∶20，加入60%乙醇，分别提取30、60、90、120、150、180 min，温度75℃，提取2次，取1 mL上清液于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，按“2.1.3”项下方法测定，计算总黄酮含量。当提取时间为120 min时，沙生蜡菊总黄酮含量最高，见表3。

表3 提取时间对沙生蜡菊黄酮提取含量的影响

2.3 正交实验根据单因素实验的结果，以乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)为考察因素，总黄酮的含量为考察指标，设计3个水平3个因素，通过L9(33)做正交实验设计，见表4。总黄酮的最佳提取工艺为A2B2C2,即60%的乙醇溶液，物料比为1∶20,提取120 min。由方差分析可以看出，因素A(乙醇浓度)、因素B(料液比)、因素C(提取时间)都具有显著性差异(P<0.05)，各因素对沙生蜡菊总黄酮含量影响的主次顺序为B(料液比)>A(乙醇浓度)>C(提取时间)，正交实验结果与单因素实验结果相吻合，见表5-6。

表4 实验因素水平表

表5 总黄酮提取工艺正交实验结果

表6 方差分析表

2.4 最佳工艺验证实验采用优选出的最佳工艺进行验证实验，平行提取5次，计算平均总黄酮含量及其RSD值，判断此工艺的稳定性及可靠性。用60%乙醇，1∶20料液比，提取120 min，提取2次，温度75℃，平行5份，平均沙生蜡菊总黄酮含量为46.572 mg/g,RSD为2.3%，见表7。

表7 验证实验结果

3 讨论

本研究采用乙醇回流提取法提取沙生蜡菊总黄酮，通过对乙醇浓度、料液比、提取时间3个因素进行单因素考察，通过正交实验优化了沙生蜡菊总黄酮的提取工艺。结果表明，对沙生蜡菊总黄酮提取率的主要影响因素为料液比，其次是乙醇浓度和提取时间。本方法设备要求简单，操作简便，成本较低，适用于沙生蜡菊总黄酮的提取。