自噬相关蛋白在2型糖尿病大鼠胰腺组织中的变化

杨雯雯， 魏 巍， 张 丽

(新疆医科大学第二附属医院， 乌鲁木齐 830063)

糖尿病是一组由多种病因引起的慢性高血糖为特征的代谢性疾病，是由于胰岛素分泌和(或)作用缺陷引起。2017年国际糖尿病联盟报告全球共有约4.25亿例糖尿病患者，我国20～79岁人群中约有1.14亿例糖尿病患者，位居世界第一[1]。糖尿病可累及全身各重要器官，其病死率逐年增加。糖尿病是由遗传和环境因素的复合病因引起的临床综合征，但目前其病因和发病机制仍未完全阐明[2]。

细胞自噬是真核细胞内高度保守的周转过程，近年来越来越多的研究阐述了细胞自噬参与了糖尿病及其并发症的发生与发展[2-4]。自噬基因微管相关蛋白轻链3(LC3)是自噬的标志物，同Beclin-1、自噬相关蛋白7(Atg7)和P62一起参与了细胞自噬的过程。本文研究旨在通过动物实验分析细胞自噬与糖尿病发生、发展的相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组将6只无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级雄性SD大鼠[6周，体质量(200±20.8) g]适应性喂养3 d，随机分为正常组和模型组(随机方法：采用随机数字表，将6只大鼠从左至右排列，左起第1只大鼠对应随机数字表第1个数字，以此类推；再将得到的6个数字从大到小排列，前3个数字对应的大鼠为正常组，后3个数字对应的大鼠为模型组)。

1.2 主要仪器及试剂

1.2.1 仪器 电泳仪(BIO-RAD公司，型号mini protean 3 cell)，电转仪(大连竞迈科技有限公司，型号PS-9)，酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司，型号MK3)，移液器(赛默飞世尔科技有限公司)，水浴锅(莱卡公司，型号HI1210)，一体式化学发光成像仪(上海勤翔科学仪器有限公司，型号5300 Pro)，所需仪器设备：冷冻切片机(莱卡公司，型号CM3050S)；荧光倒置显微镜(莱卡公司，型号IX71)。

1.2.2 试剂 链脲佐菌素(STZ，Sigma生产，货号S0130)，柠檬酸(上海国药，货号XW00779291)，柠檬酸三钠(上海国药，货号10019408)，BCA蛋白定量试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司，货号KGDBCA)，PBS磷酸盐缓冲液(实验者配制)，蛋白预染Marker(赛默飞世尔科技有限公司，货号26616)，pvdf膜(密理博公司，货号HATF00010)，吐温20(Amresco公司，货号BYL40713)，10%福尔马林(上海国药，货号H-50-00-0)，10%EDTA(Sigma，货号1233508)，LC3抗体(Santa Cruz Biotechnology，货号sc-134226)，Beclin-1抗体(Santa Cruz Biotechnology，货号sc-11427)，辣根过氧化酶标记的二抗(中杉金桥，货号：ZB2305)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备 正常组喂以常规饲料，模型组喂以高糖高脂饲料(自配：10%猪油、20%蔗糖、2.5%胆固醇、1%胆酸盐和66.5%常规饲料)，喂养4周；4周后隔夜空腹给予模型组腹腔注射STZ 30 mg/kg/体质量(溶于0.1 mol/L枸橼酸盐缓冲液，PH 4.4)2次，1周后再次给予30 mg/kg/体质量，正常组注射相应体积的生理盐水。STZ注射4周后大鼠禁食，剪尾取血，测量空腹血糖，以空腹血糖>7.8 mmol/L为糖尿病诊断标准。模型构建成功后处死正常组和模型组，取大鼠胰腺组织进行实验。所有实验动物的操作均符合新疆医科大学伦理委员会标准。

1.3.2 蛋白质免疫印迹法(Westorn Blot，WB)检测蛋白表达水平 (1)样品准备: 称取适量的大鼠胰腺组织，液氮研磨后用适量预冷的已加苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液混匀，充分裂解后以12 000 r/min离心10 min，取上层水相，进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱。(2)蛋白定量: 将试剂A(1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.16%酒石酸钠、0.4%氢氧化钠和0.95%碳酸氢钠混合，调pH值至11.25)与试剂B(4%硫酸铜)按体积比为50∶1配制适量聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)工作液，充分混匀；各孔加入160 μL BCA工作液；酶标板振荡30 s，37℃放置30 min，后加入2 μL待测蛋白和18 μL磷酸盐缓冲液(PBS)，在562 nm下测定吸光度。以吸光度为纵坐标，蛋白浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线；正常组的实测吸光度(OD值)1.135，蛋白浓度为2.488 mg/mL；模型组的实测OD值为1.119，蛋白浓度为2.449 mg/mL。(3)上样电泳:将配制好的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)胶放入电泳槽中，加入适量电泳缓冲液，沸水浴10 min后离心取上清上样。(4)膜上蛋白的检测：将膜放入三羟甲基胺基甲烷-吐温缓冲液(TBST)洗1次，再置于丽春红染色工作液(2%的丽春红贮备液1∶10稀释)，在室温下摇动染色5 min。(5)膜的封闭及抗体孵育：稀释抗体Atg7、LC3、Beclin-1、P62加入5%脱脂奶粉和膜4℃孵育过夜。按照1∶5 000稀释HRP标记的二抗，与膜37℃孵育1 h。(6)采用蛋白质免疫印记法，一体式化学发光仪检测。将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析处理。以Actin蛋白为内参照对Atg7、LC3、Beclin-1、P62 4种目标蛋白进行灰度值分析，蛋白相对表达量=目标蛋白OD值/内参照OD值。

1.3.3 免疫组织化学检测 采用SP染色法，将处死的大鼠置于75%乙醇中浸泡消毒5～10 min，取大鼠胰腺组织以包裹剂包埋后冷冻切片，切片厚度5 μm；对切片进行染色和相关处理后封片；荧光显微镜下观察LC3和Beclin-1蛋白在大鼠胰腺组织中的表达。

1.4 统计学处理采用 SPSS20.0 软件对数据进行统计分析。正态分布的计量数据以表示，组间比较采用独立样本t检验。运用免疫组化分析软件Image J分析每个标本的累积光密度值与有效面积、累积光密度值/有效面积，即为平均光密度值，再运用ORIGIN6.0分析出P值和t值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 WB法检测蛋白表达水平 与正常组比较按OD值来计算与衡量，模型组大鼠胰腺组织LC3、Atg7和Beclin-1蛋白表达量增加(P均<0.01)，P62蛋白表达水平降低(P<0.01)(表1、图1)。

表1 2组蛋白表达水平比较值)

图1 2组蛋白表达水平检测

2.2 免疫组织化学检测经SP法免疫组织化学染色，模型组LC3和Beclin-1蛋白特异性强，细胞浆呈棕色为阳性反应(图2)。

模型组 正常组

3 讨论

细胞自噬这一概念最早出现于20世纪60年代，它是真核细胞内一套高度保守的周转途径，是异常蛋白和细胞器被运送到溶酶体进一步降解的过程。在细胞和生理水平的生物学过程中发挥了重要作用，过强的自噬诱导可以导致细胞死亡。

LC3是自噬的标志物，其靶向定位于自噬体膜，通过参与自噬体形成调控细胞自噬。有研究报道在肝癌组织中LC3的阳性表达明显高于正常肝组织[5]，表明自噬的增强可能与肝脏肿瘤的发生有关。本研究选择LC3作为检测蛋白之一，结果显示WB法检测LC3在模型组的表达量明显高于正常组，免疫印迹法检测LC3在模型组中表达明显增加，表明糖尿病大鼠胰腺组织细胞自噬较非糖尿病大鼠增强，除了细胞自噬减弱可能导致组织细胞损伤外，过度发生的细胞自噬也可能导致胰腺组织细胞损伤，进而导致糖尿病的发生。有研究提出STZ糖尿病模型大鼠心肌组织中LC3Ⅱ的蛋白表达最终表现为降低，表明随着糖尿病病程的增加，心肌细胞难以维持正常的自噬，不能清除代谢产物，导致心肌损伤[6]。徐琰瑛[7]的研究提出通过WB法检测大鼠视网膜组织LC3Ⅱ蛋白水平，相对于正常组大鼠，LC3Ⅱ在糖尿病视网膜病变组大鼠中的表达明显降低。上述研究均表明细胞自噬的降低可导致糖尿病大鼠中心肌细胞和视网膜组织发生病变。段玲弟等[8]的研究表明，与正常组比较，糖尿病模型组LC3表达水平下降，经胰岛素治疗后，LC3表达水平上升。胰腺β细胞是分泌胰岛素的场所，糖尿病病程的增加，胰腺β细胞可能难以维持一定的自噬水平，胰腺β细胞损伤，进而导致糖尿病的进展。目前较多研究提示自噬降低可能导致糖尿病及相关并发症的发生，本研究显示，过度的自噬可能导致糖尿病的发生，表明自噬功能的紊乱(增强或下降)都可能导致疾病的发生，需要进一步的研究加以证实。

胰腺β细胞自噬既能保护胰腺β细胞，也可以诱导胰腺β细胞凋亡。Beclin-1是细胞自噬的重要一员，也是酵母自噬基因Atg6/Vps30的同源基因，其蛋白含有中央螺旋区、进化保守区和BH3 3个结构域[9]，这些结构域与其它因子相互作用，参与自噬体形成的调控过程，在疾病的发生、发展中发挥重要作用[10]。研究显示，与非糖尿病者的胰腺组织比较，2型糖尿病患者的胰腺β细胞有自噬泡和自噬体的积累，存在过度的自噬，导致β细胞的死亡数目明显增加[11]。胰腺β细胞损伤导致胰腺分泌胰岛素减少，导致了糖尿病的发生。自噬具有自限性，自噬的持续存在可能导致细胞组织的过度死亡。自噬的自限性由自噬关键因子调控，本研究得出自噬相关蛋白Beclin-1在模型组大鼠胰腺组织的表达较正常组增加，细胞自噬可能参与糖尿病的发生与发展。

Atg7是胰岛β细胞自噬的重要基因，Atg7的缺陷可能导致经典自噬功能受损，甚至缺失。本研究结果提示模型组胰腺组织Atg7蛋白表达水平升高，同样提示模型组胰腺组织细胞自噬功能增强，引起胰腺β细胞过度损伤，进而导致糖尿病发生。有研究发现Atg7缺陷的小鼠胰岛β细胞功能减退，胰腺分泌胰岛素明显减少，致血清胰岛素浓度下降，糖耐量减低，导致糖尿病的发生[12]。Jung等[13]的研究提示Atg7缺陷的小鼠胰岛β细胞线粒体和内质网肿胀，泛素化蛋白聚集形成过多的包涵体，过量的包涵体形成导致胰岛β细胞自噬功能缺陷。上述两项研究与本研究结果不一致，可能与本研究实验动物例数较少或实验动物品系不同有关，需要进一步研究加以明确。

P62作为信号转导途径中的适配子蛋白，可以与多种蛋白质相互作用，参与泛素蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统两种蛋白降解过程，在β细胞的选择性自噬中发挥重要作用，因而可能与糖尿病发病相关。本研究结果提示模型组胰腺组织P62蛋白表达水平比正常组降低，考虑与模型组胰腺组织自噬上游表达减弱或者下游降解增加，P62表达水平下降，纳入成熟的自噬体内的P62减少，随之自噬体内降解的P62减少，P62的水平与自噬呈负相关关系。

总之，细胞自噬与多种生命活动息息相关，本结果提示在糖尿病大鼠模型胰腺组织中LC3、Atg7和Beclin-1蛋白表达量增加，P62蛋白表达量降低，上述4种蛋白均为细胞自噬的重要蛋白，在糖尿病模型大鼠中以上4种蛋白均出现异常，表明细胞自噬功能的紊乱可能导致糖尿病的发生。