血清相关因子联合循环miRNA在胰腺癌早期诊断中的应用研究

罗奇智 林丽云 周 莉 许建平 罗文沈 王建蔚 杨联君 陈斯亮

1.深圳市龙岗区第二人民医院，广东深圳 518112；2.深圳市龙岗区中心医院，广东深圳 518117

胰腺癌是全球范围内最常见的肿瘤之一，并且在我区也是癌症致死原因的一种主要类型[1]。大样本多中心的研究发现很多基因参与了胰腺癌发生，因此，对胰腺癌相关发病病因及其联系相关基因分析，详细了解有关胰腺癌分子遗传学机制，为后期临床医学者对胰腺癌诊断、治疗提供理论基础，成为现阶段研究热点问题[2]。通过特异基因学标记和相关表型改变，上述标记作用利于对胰腺癌高危人群识别，使早期发现、预防、治疗成为可能[3]。近年来研究发现，通过检测胰液miRNAs 成分，可作为早期临床诊断一项指标[4]，为探讨miRNA-203、CA199、CEA 基因在胰腺癌发生发展过程中的作用以及作为胰腺癌的早期诊断筛查的分子指标的可能性，本研究通过搜集我院胰腺癌患者的病例样本共计698 例，其中36 例证实为胰腺癌样本，旨在进一步了解其筛查效果。

表1 miRNA-203、CA199、CEA的相对表达量与临床病理特征之间的相关性（±s）

表1 miRNA-203、CA199、CEA的相对表达量与临床病理特征之间的相关性（±s）

临床病理特征 n miRNA-203达量 CA199达量 CEA表达量 F P性别 女 16 1.59±0.24 1.40±0.25 1.42±0.24 2.940 0.063 男 20 1.65±0.36 1.59±0.15 1.47±0.36 1.790 0.176年龄（岁） ≤60 18 1.49±0.17 1.48±0.36 1.46±0.15 0.070 0.933 ＞60 18 1.46±0.15 1.45±0.13 1.43±0.21 0.150 0.060分化程度 低 12 1.20±0.16 1.36±0.19 1.22±0.14 3.370 0.047 中 12 1.64±0.18 1.56±0.17 1.45±0.17 3.630 0.038 高 12 2.01±0.19 1.23±0.18 1.88±0.25 47.990 0.000浸润深度 T3+T4 18 1.28±0.14 1.51±0.14 1.25±0.36 6.470 0.003 T1+T2 18 1.56±0.13 1.26±0.14 1.47±0.24 7.380 0.002淋巴结转移 有 20 1.21±0.17 1.97±0.15 1.35±0.36 54.230 0.000 无 16 1.99±0.15 1.30±0.36 1.89±0.19 35.460 0.000远处转移 无 20 1.67±0.18 1.26±0.19 1.48±0.21 22.430 0.000 有 16 1.05±0.15 1.50±0.17 1.44±0.18 34.200 0.000肿瘤大小 ＞5cm 19 1.45±0.19 1.44±0.17 1.48±0.21 0.230 0.798 ≤5cm 17 1.43±0.17 1.42±0.16 1.41±0.18 0.060 0.943

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入我院拟诊断胰腺癌患者的病例样本共计698 例，其中有36 例证实为胰腺癌样本（注：部份病例由深圳市龙岗区中心医院提供），本次试验开展对胰腺癌浸润程度按照国际抗癌联盟标准分类[5]，并采用国际WHO 诊断标准对淋巴分化进行诊断[6]。纳入标准：（1）所有患者经过临床病理诊断确诊为胰腺癌患者；（2）纳入对象均为初诊患者；（3）术前未实施有关治疗措施；（4）经过我院伦理委员会批准。排除标准：（1）未签订知情同意书；（2）一般资料不全者。胰腺癌组中男20 例，女16例，年龄65～88 岁，平均（71.3±1.6）岁。正常对照组中男452 例，女210 例，年龄64～89 岁，平均（72.4±2.5）岁，两组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。具有可比性。

1.2 实验仪器和试剂

1.2.1 仪器 赛默飞HM340 切片机，徕卡 Excelsior AS 冰冻机，奥林巴斯BX53 显微镜，美国ABI-750 实时荧光PCR 分析仪，雅培I2000 化学发光分析仪。

1.2.2 试剂 RNA 提取试剂及TaqMan RNA 检测试剂由中山大学达安基因股份有限公司提供，达安基因，CEA、CA199 检测的雅培原装试剂由深圳市安研有限公司提供。

1.3 实验方法

所有研究对象抽取外周血，使用雅培I2000 化学发光分析仪检测外周血的血清中CEA 及CA199的表达情况。本次试验开展纳入对象均予以RNA提取试剂盒进行RNA 提取，miRNA-203 的相对表达量采用TaqMan RNA 试剂盒检测，将RNU6 作为内参并进行校正。试验开展利用荧光实时定量反应，严格按照PCR 操作说明书进行。当检测结果中Ct 数值显示为20～32 之外时，需采取第二次检测。计算采取公式为△Ct=CtmiRNA-203、CA199、CEA-CtRNU6，反应miRNA-203 的相对表达量。

1.4 统计学处理

采用SPSS19.0 统计软件对数据进行统计分析。计量资料以（）表示，采用独立样本t检验，组内比较采用配对样t检验，多组间对比选择F检验，将临床病例因素作为自变量进行多元Logistic回归分析，采用Pearson相关性分析计算相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

表2 miRNA-203、CA199、CEA相对表达量的高低与临床病例因素之间的关系

2 结果

2.1 miRNA-203、CA199、CEA的相对表达量与临床病理特征之间的相关性

miRNA-203、CA199、CEA 的相对表达量分别为1.036，1.532，1.135，95%CI为0.323～0.534，0.369～0.547，0.412～0.632。miRNA-203、CA199、CEA 相对表达量与患者的年龄、性别、发病的部位及瘤组织大小并无相关性（P＞0.05）；而淋巴受累、肿瘤分期、分化程度、肿瘤侵袭深度、是否转移等方面，CA199、CEA、miRNA-203 相对表达量的上升（P＜0.05），CA199、CEA、miRNA-203 相对表达量的上升与淋巴受累、肿瘤分期、分化程度、肿瘤侵袭深度、是否转移风险有关，见表1。

2.2 miRNA-203、CA199、CEA相对表达量的高低与临床病例因素之间的关系

采用Logistic回归分析分析miRNA-203、CA199、CEA 相对表达量的高低与临床病例因素之间的相关性，CA199、CEA、miRNA-203 相对表达量的上升增加了淋巴结转移的风险，调整之后风险的OR=5.05，95%CI为1.14～23.45，P=0.004，见表2。

2.3 miRNA-203、CA199、CEA mRNA表达情况比较

胰腺癌组与对照组miRNA-203、CA199、CEAmRNA 表达情况比较，胰腺癌组CA199 相对表达量的上升，CEA、miRNA-203 表达的下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

随着现阶段我国诊断技术不断先进，对胰腺癌患者实施分子生物学检查具有一定优势，能应用于疾病早期诊断及其筛查，利于后期疾病治疗，改善预后[7]。现阶段临床对疾病诊断实施采用新技术，具有特异性差、敏感性低缺点，实际应用过程中会存在假阳性、假阴性，实际诊断存在一定缺陷。同时，目前实际研究过程中，对分子标志物均是有关肿瘤相关性，并非特异性[8-9]。此外，对任何一类肿瘤早期诊断、筛查并非完全依靠单向操作方式完成，现阶段胰腺癌筛查、早期诊断均是以多项指标联合检测以提高早期诊断率。

表3 miRNA-203、CA199、CEA mRNA表达情况

癌胚抗原（CEA）诊断胰腺癌的特异度非常高，从而保证了其诊断的准确性，但是灵敏度却较低，但是CEA 也因其非器官特异性，影响临床判断，因此，不能单一的作为胰腺癌的肿瘤标志物[10]。研究表明，胰腺癌血清中存在大量的CA199，并且具有极强的特异性87%和灵敏度79%，在胰腺癌早期诊断及预后方面都有很高的参考价值[11]。但是CA199 也存在于结肠肿瘤或胆道或急性胆管炎患者血清中，因此，也不能单一作为胰腺癌的早期诊断分子标志物[12]。miRNAs 作为一类具有调控功能非编码小分子RNA，并广泛存在于真核生物中，因此，miRNAs 会因肿瘤组织自身所存在特异性、稳定性成为一种潜在分子标志物[13-14]。有学者经过Meta 分析发现，miRNAs 诊断胰腺癌的敏感度高达89%，特异度高达93%，血清及其组织中存在异常表达miRNAs，同时并对血清中miRNAs 进行验证，miRNA-203 可以作为胰腺癌潜在的血清分子诊断标志物[15]。

本研究通过联合检测miRNA-203、CA199、CEA 表达程度及其与临床特点的相关性，以期了解miRNA-203、CA199、CEA 基因在胰腺癌发生发展过程中的作用以及作为胰腺癌的早期诊断的分子指标的可能性，结果显示，CA199、CEA、miRNA-203 相对表达量的上升，增加了淋巴结转移的风险，组间比较差异均具有统计学意义。

综上，miRNA-203、CA199、CEA 的联合检测与胰腺癌发生发展及预后有一定的相关性，有助于肿瘤的侵袭和转移筛查及预测。

摘 要

研究类论文应写成冠以“目的（Objective）、方法（Methods)、结果（Results）和结论（Conclusion）小标题的结构式摘要。

结构式摘要的“目的”应注意与题名范围对应，目的与结论呼应；“方法”需交代病例收集来源、时间，分组方法，研究指标及方法，统计学方法；“结果”需给出主要指标的数据，给出统计学处理结果（统计量和统计值），结果中的指标应与方法中提及的对应；“结论”与目的呼应，不做不成熟的论断；慎用“本研究证实”、“本研究发现”、“本研究表明”、“本研究显示”的表述，建议使用“本研究提示”。建议前瞻性临床试验研究的论著摘要应含有CONSORT 列出的基本要素。综述、述评、个案报道、经营管理、政策研究等方面文章的摘要采用叙述式。

摘要的内容应包括综述的主要目的、资料来源、综述时所选择的研究数目及这些研究是如何选择的、提炼数据的规则及这些规则是如何应用的、数据综合的最重要的结果和结论。

摘要应着重反映研究中的创新内容和作者的独到观点；不要简单地重复题名中已有的信息。摘要具有自明性，可独立成文。摘要中不列图、表，不引用文献，不加评论和解释。

摘要中可以使用公知公认的缩略语、代号等。除了公知公认者外，摘要及正文首次出现时须注明全称或加以说明，其后应直接使用缩略语。新术语或尚无合适汉语译名的术语，可使用原文或在译名后括号中注明原文。

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