植物源性食品中抗生素残留分析方法研究进展

周 杰 安 姣 董 超 赵 静 张耀海 焦必宁

(西南大学柑桔研究所，重庆 400712)

抗生素是微生物或高等动植物代谢产生的具有抗病原体或其他活性的次级代谢产物，广泛用于动物疾病防治或作为饲料添加剂用于促进动物生长，因此其在动物源性食品中的残留问题普遍受到关注，相应的研究也较多[1-3]。而抗生素作为农药用于防治植物病虫害会残留在农产品上，环境中的抗生素通过作物吸收也会进入食品中，植物源性食品中抗生素残留同样会对人体健康构成威胁。但目前对该问题关注度较低，相应的研究和综述也较少。本文介绍了中国抗生素农药的基本情况，重点对其前处理和检测技术进行较详细的综述。

1 中国抗生素农药登记及其限量标准

抗生素农药是指具有农药功能、用于防治病虫草鼠等有害生物的天然代谢产物，属生物农药范畴。中国登记的抗生素农药的有效成分有21种，大多为链霉菌所产生的代谢产物，农药产品有2 200多个，约占生物农药总数的70%[4]。目前，仅阿维菌素、多杀菌素、春雷霉素、多抗霉素、宁南霉素、井冈霉素、伊维菌素和灭瘟素8种有效成分在食品安全国家标准[5]中有限量要求，且多为临时限量，有限量要求的作物种类也较少，如后两者分别仅对结球甘蓝(0.02 mg/kg)和糙米(0.1 mg/kg)有限量要求。

2 植物源性食品中抗生素来源及在作物中的累积

施用抗生素农药会直接残留在植物上，是植物源性食品中抗生素的主要来源。土壤、水体等环境介质也是植物源性食品抗生素的重要来源。抗生素主要通过人类和动物尿液和粪便进入环境，最终通过淋溶或地表径流污染土壤、地表水和地下水[6]。同时，医用抗生素可通过废水排出或农业灌溉而进入环境。此外，喷施抗生素农药也会不可避免地残留于土壤和水体中。这些抗生素通过以上各种途径进入环境中，进而被植物组织不同程度吸收，通过食物链进入人体，对人体健康构成潜在的危害。

已有多篇报道涉及抗生素在植物中的累积[7-8]、迁移和转运机制[9]、对植物生长[10-11]以及人体膳食风险评估的影响[9,12]。Kang等[13]研究了有机肥中5种抗生素在11种蔬菜中的累积情况，发现绝大多数蔬菜都可吸收有机肥中抗生素，但浓度一般都小于定量限(10 μg/kg)，不会对人体造成健康风险。Ahmed等[14]研究了四环素类(TCs)和磺胺类(SAs)(5，10，20 mg/kg)对黄瓜、番茄和生菜生长的影响及其在作物中的分布及累积情况。结果显示：SAs和TCs对3种蔬菜生长均具有负面作用，并与浓度呈正相关。抗生素对植物的毒性效应不同，与其在土壤中吸附，降解及与金属螯合等作用有关，SAs在土壤中具有较高的迁移性，易被植物吸收，毒性效应强于TCs。此外，抗生素在不同植物和组织中的累积程度不同。对于TCs而言，其在作物中的累积量为番茄(1.021～5.104 mg/kg)>黄瓜(0.574～3.418 mg/kg)>生菜(0.459～1.892 mg/kg)，在叶和根中高于果实。土霉素和金霉素在同一部位的积累量普遍高于四环素。对于SAs而言，其在作物中的累积量为番茄(32.879～101.799 mg/kg)>生菜(18.169～64.458 mg/kg)>黄瓜(15.916～40.341 mg/kg)，积累趋势与TCs相似，但积累水平远高于TCs。由于试验条件下抗生素浓度较高，导致了其在植物中的累积水平也较高，但在实际样品检测中，抗生素浓度较低，一般在10-9的水平，如喹诺酮类(QNs)和SAs在蔬菜(干重)中的浓度分别为10.56～193.25 μg/kg[15]和<32.7 μg/kg[16]。

3 样品前处理方法

3.1 提取方法

植物源性食品中抗生素的提取主要采用溶剂提取法。多数抗生素的结构中包含极性较强的官能团，因此常采用极性溶剂(如乙腈[17]、水[18]、丙酮[19]、甲醇[20]等)作为提取剂，也有用磷酸缓冲液(PBS)[21]的。因样品常含有色素、纤维素和碳水化合物等物质，基质较为复杂，抗生素可通过氢键、疏水作用力及色散力等与之吸附或络合，导致单一溶剂的提取效果较差，尤其是多抗生素残留的同时检测。因此，目前大多选用乙腈、甲醇、丙酮和水的混合溶剂提取[20,22-24]。Chuang等[25]研究发现乙腈、甲醇和水的比例为46∶25∶29时，蔬菜中7种抗生素回收率在70%以上。此外，一些抗生素含碱性或酸性基团，在不同pH溶液中可呈现出不同的离子形态，因此在提取剂中常加入酸(如盐酸[15]、1%甲酸[26]、0.1%～4%乙酸[16,27]、1%柠檬酸[28])或盐(Mcllvaine缓冲液)。四环素类抗生素可与金属离子螯合，还需在提取剂中添加EDTA等络合剂[29]。

溶剂提取常辅以超声、振荡等方式。超声提取具有效率高、用时短、设备易得的优点，但会导致部分抗生素发生降解，因此也常用振荡提取代替。李学德等[30]在测定蔬菜中3种SAs残留时，发现振荡提取的回收率(83.6%～88.0%)比超声提取的(77.9%～85.2%)略高。此外，这2种方式也常结合使用[15-16,31]。加压溶剂萃取法(PLE)具有溶剂用量少、提取充分、操作快速、可重复性高等优点，也常被用于植物中抗生素的提取。Azanu等[32]以水为提取剂，70 ℃加压萃取10 min，经SPE净化，测得胡萝卜和生菜中四环素和阿莫西林的回收率可达86.1%以上。

3.2 净化方法

目前，植物源性食品中的抗生素残留检测常用的净化方法有液—液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、QuEChERS、分散液液微萃取(DLLME)以及基质固相分散(MSPD)等。

LLE是食品中抗生素传统的净化方法，植物源性食品中的抗生素最常用的萃取溶剂是正己烷和二氯甲烷。Liu等[33]采用丙酮/水(体积比1∶1)提取，再以正己烷液—液萃取，利用UPLC-FLD测定了蔬菜中阿维菌素和伊维菌素，其回收率分别为80.3%～110.2%和82.4%～103.4%。但由于该方法操作繁琐费时，并需大量有机溶剂，目前已结合SPE使用或被其取代。

与LLE相比，SPE可同时完成样品富集和净化，回收率和灵敏度高，是食品中抗生素残留检测最常用的净化手段。常用的SPE小柱有HLB柱、C18柱、SCX柱和Florisil柱等，其中，HLB柱的填料为N-乙烯基吡咯烷酮(亲水性)-二乙烯基苯(亲脂性)，具有两亲平衡性，对多数抗生素具有良好净化的效果，应用最为广泛。Wang等[34]建立了同时检测果蔬中春雷霉素和井冈霉素A的HPLC-TOF-MS/MS方法：样品经乙腈/水(体积比70∶30，pH 5.5)提取，再经HLB与SCX串联小柱净化，目标物回收率较好(81.7%～108%)。Aldeek等建立了柑桔[35]和橙汁[21]中的青霉素G及其代谢物残留检测方法：样品经PBS提取，HLB柱净化，UPLC-MS/MS检测，回收率为82%～120%。此外，一些纳米材料因其独特的理化性质也被用作SPE填料。石墨烯是一种二维平面的碳纳米材料，比表面积较大，分子易在其表面被吸附和洗脱。采用石墨烯净化蔬菜中SAs，其效果较C18硅胶和多壁碳纳米管好[31]。

QuEChERS法是一种集提取与净化于一体的方法，其常用的净化剂是乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基甲硅烷基(C18)和石墨化炭(GCB)。Yu等[36]利用QuEChERS-UPLC-MS/MS法同时检测了叶菜中20种抗生素残留，平均回收率为57%～91%。Hu等[24]也建立了同时检测叶菜类蔬菜中26种杀菌剂抗生素残留的QuEChERS-HPLC-MS/MS法，结果表明大部分抗生素的回收率为60.0%～98.0%。尽管QuEChERS法的净化效果不如SPE，并且一些净化剂如GCB的使用会降低部分抗生素的回收率，但因其操作简便，无需特殊仪器设备，有机溶剂用量较少，环境友好等，仍成为目前处理大批量样品中抗生素多残留检测常用方法。

DLLME是一种能够实现快速萃取富集的微型化LLE，具有操作简单、有机溶剂用量少、富集倍数高等优点。Pirsaheb等[37]利用悬浮固化—分散液液微萃取(DLLME-SFO)检测了苹果中的阿维菌素，二嗪农和毒死蜱残留：以乙腈为分散剂，1-十一烷醇为萃取剂，HPLC-UV检测，回收率为68%～82%。由于所用的萃取剂多为含氯有机化合物(如氯仿和二氯甲烷)，毒性较大，挥发性强，易对操作人员和环境造成较大毒害[38]，而且DLLME除杂能力较弱，难以应对复杂基质的植物源性食品，故应用较少。

MSPD是在SPE基础上发展而来的集样品匀浆、提取、净化和富集于一体的方法，具有省时省力、快速高效的特点。Zhang等[39]将大米样品与碱性氧化铝1∶2混合研磨，再转入MSPD柱中洗脱，同时用微波辅助萃取，得到阿维菌素回收率为88.6%～91.0%。微波可使样品温度升高，从而加快MSPD进程，并提高目标物的回收率，因此，该方法用于大米中阿维菌素的检测具有显著的优越性。

表1列出了近年来有关植物源性食品中抗生素的前处理和检测的方法。

3.3 植物源性食品基质效应

植物源性食品基质效应(Matrix effects，ME)与前处理方法、食品种类、部位及抗生素种类和性质等因素有关。不同净化方式对果蔬中抗生素基质效应不同。用HLB柱净化后，果蔬基质对春雷霉素和井冈霉素A的抑制效应较强(ME为-80.4%～-34.2%)，用SCX柱净化后，基质效应明显降低(ME为-31.4%～5.23%)，而用HLB柱串接SCX柱后，基质效应可忽略(ME为-11.2%～6.11%)[34]。同一种或同一类抗生素在不同基质中的基质效应表现不同。在叶菜、根菜和果菜类基质中，TCs有增强也有抑制效应，但基质干扰程度较低；SAs总体表现为抑制效应且在白萝卜上表现强烈(ME为-72.3%～-51.6%)；大环内酯类、截短侧耳素类抗生素在大部分基质中表现为抑制效应，而林可酰胺类抗生素却表现为较低的增强效应；氟喹诺酮类抗生素除恩诺沙星和二氟沙星无明显基质效应外，其他均表现出强烈的增强或抑制效应(ME为50.9%～75.5%和-75.3%～-50.5%)[33]。同一种基质对于不同抗生素表现出不同的基质效应，叶菜类蔬菜对氟喹诺酮类抗生素的基质效应较小(ME为-20%～29%)，对SAs有中等程度的抑制作用(ME为-60%～-14%)，而对TCs中的四环素基本无基质效应(ME为-7%)，但对土霉素和金霉素却有强烈的增强效应(ME分别为74%和63%)[40]。此外，作物不同部位的基质效应也稍有差异。水稻不同部位对井冈霉素A的抑制程度有所差别，为稻壳(ME为-82.0%)>糙米(-74.6%)>稻草(-72.4%)[50]。目前很多研究[21,26,36]评估了样品分析过程中基质效应的大小，但在其影响因素、作用机理等方面还需深入研究。

4 色谱方法

目前关于食品中抗生素检测以色谱法为主，而液相色谱更是植物源性食品中抗生检测的主流方法，食品安全国家标准也采用液相色谱法测定植物源性食品中阿维菌素[51-52]和井冈霉素[53]。此外，还有少量用酶联免疫法(ELISA)的报道[16,54]。

表1植物源性食品中抗生素的检测方法
Table 1 Detection of antibiotics in plant-derived foods

续表1

4.1 高效液相色谱

测定植物源性食品中抗生素残留所用色谱柱主要是C18柱，少数用C8柱[19]。流动相多为乙腈—水[35]、甲醇—水[37]，少数为乙腈—甲醇—水[22]。为改善峰型和提高分离度，常在水相中加入乙酸铵[49]、甲酸[36]、乙酸[43]等，添加量一般为0.05%～0.50%。检测器主要是紫外吸收检测器(UV)、荧光检测器(FLD)，少数是光电二级管阵列检测器(DAD)[55]。利用HPLC-UV检测苹果[34]、柑桔[42]、龙眼[56]中阿维菌素的LOD分别为0.7，30.0，5.0 μg/kg；检测蔬菜中SAs的LOD为6.3～21.1 ng/L[32]。FLD的灵敏度比UV高，但被测物需有强的荧光反应，若被测物没有产荧光基团，则需进行衍生化作用，操作步骤较繁琐。利用HPLC-FLD检测果蔬中阿维菌素类LOD为0.1～10.0 μg/kg[17,23]，SAs的LOD为1～5 μg/kg[16]；检测黄瓜、大白菜中链霉素的LOD为10 μg/kg[47]。

4.2 液相色谱—质谱联用

液相色谱—质谱联用结合了色谱的高分离性和质谱的高鉴别能力的优点，是植物源性食品中抗生素残留检测的主要方法。因串联质谱(MS/MS)的灵敏度和选择性要显著高于单级质谱(MS)，目前普遍采用高效液相色谱串联质谱仪(HPLC-MS/MS)，其中以三重四极杆质谱(QQQ)和四极杆线性离子阱质谱(Q-Trap)应用最为广泛[21,24,49]。采用HPLC-MS/MS(QQQ)测定，植物源性食品中阿维菌素、春雷霉素、SAs、QNs等抗生素的LOD在0.09～30.00 μg/kg(或μg/L)[13,40,43,57]，其中泰妙菌素的LOD可达0.005 μg/kg[24]。以HPLC-MS/MS(Q-Trap)检测植物源性食品中的多杀菌素、多抗霉素D、青霉素G及其两种代谢物等抗生素的LOD分别为2～29[44]，50[26]，0.1[21]μg/kg。与QQQ和Q-Trap相比，四极杆飞行时间质谱(Q-TOF)分辨率较高(>10 000)，质量范围较宽(上限约15 000道尔顿)，因此在高相对分子质量分析中具有重要作用，但其线性范围较窄、灵敏度较低且成本较高，在常规实验室或日常定量检测中使用相对有限。考虑到Q-TOF的高选择性，相信未来其将逐渐成为食品中抗生素残留测定的重要工具。

5 展望

目前已有少许果蔬、粮谷等农产品中抗生素残留检测方法的报道[29,31,36]，但主要是仪器检测法，方法较为单一。由于植物源性食品的保鲜及储藏问题，开发如胶体金试纸条等现场快检方法和Q-TOF等实验室快速筛查方法将是今后植物源性食品抗生素残留检测研究的一个重点方向。同时，目前关于植物中抗生素的分析方法多关注于某一种或一类抗生素的检测，方法的适用面较窄，并且对代谢产物的检测分析研究较少。因此为全面准确地评估人类通过膳食的暴露风险，需要加强对多类型抗生素同时检测和对其代谢物的检测研究。另外，在基质效应的主要影响因素、形成机理等方面还需要进一步研究。这些问题的研究和解决，有助于进一步建立高效快捷、灵敏稳定、自动化程度更高的抗生素多残留检测技术。