谷氨酸—木糖美拉德中间体的水相制备及其在桃酥中的应用

徐 慢 孙福犁 崔和平 于静洋 张晓鸣

(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

美拉德反应是羰基和氨基化合物脱水缩合最终形成褐色聚合物类黑精[1]的一种非酶促褐变反应，产生的醛、酮、吡嗪、呋喃等挥发性物质赋予食物令人愉悦的香气，在香精工业中得到广泛的应用[2]。完全美拉德反应香精风味浓郁，但香气损失快[3]；而美拉德反应中间体(Maillard reaction intermediate，MRI)作为风味化合物前体，具有稳定的化学性质，本身无香味也不会褐变，但可通过后续热加工过程继续发生美拉德反应而产生风味[4]，这使得MRI具有代替完全美拉德香精应用于食品中的潜力。

对于无羟基保护的MRI的合成，目前集中在以甲醇作为溶剂的研究中[5-6]，该方法操作简单、转化率高，但因成本较高不适合工业化生产而仅适用于实验室研究，还会带来环境问题[7]。以水作为溶剂可缓解环境问题，但水相中的美拉德反应是一系列的多级联反应，会产生多种副产物而导致MRI产量较低。而谷氨酸的两个羧基抑制其美拉德反应的活性，降低了反应速率及MRI产量，限制了谷氨酸作为美拉德反应原料的应用[8]。

Zhou等[9]发现当谷氨酸的比例较高时，美拉德反应产物可产生较强的烘烤和坚果香，为谷氨酸美拉德反应在烘焙食品中的增香提供了新思路。以谷氨酸为原料的美拉德反应主要用于改善肉的风味和鲜味[10-11]，而缺乏应用于烘焙食品的研究。桃酥作为一种中式糕点，口感酥脆、味道香甜、做法简便，广受消费者喜爱[12]，且仅由面粉、糖、油组成，体系相对简单，因此，选择桃酥体系研究MRI对烘焙食品的增香作用。

本研究拟以谷氨酸和木糖为原料，优化水相中制备MRI的工艺条件，通过热反应与真空脱水耦联的方法提高谷氨酸MRI的转化率；并将其应用于桃酥体系，通过GC/MS及感官评定等方法研究其对桃酥风味的影响，为谷氨酸MRI在烘焙食品中的应用及开发提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

D-木糖、L-谷氨酸：食品级，上海源叶生物科技有限公司；

L-半胱氨酸、氢氧化钠、甲酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

乙腈：HPLC级，国药集团化学试剂有限公司；

1,2-二氯苯：标准品，国药集团化学试剂有限公司；

谷氨酸—木糖MRI纯品：纯度为98.33%，实验室自制；

正构烷烃C6～C26：标准品，美国Sigma公司；

低筋面粉、色拉油、鸡蛋、白砂糖、小苏打、泡打粉：市售。

1.1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计：UV-1800型，岛津-GL(上海)有限公司；

超高效液相色谱串联四极杆质谱仪：MALDI SYNAPT MS型，美国沃特世公司；

全数字化核磁共振波谱仪：Aduance Ⅲ 400MHZ型，德国布鲁克AXS有限公司；

旋转蒸发仪：BUCHI R-210型，上海岛通应用科技有限公司；

冻干机：SCIENTZ-18N型，宁波新芝生物科技有限公司；

三重四级杆气质联用仪：TSQ Quantum XLS型，美国赛默飞世尔科技公司；

1.2 方法

1.2.1 MRI水相制备 木糖和谷氨酸以2∶1的摩尔比溶于去离子水(总浓度为0.026 g/mL)，NaOH溶液调节pH至7后转移到美拉德反应瓶中，在90 ℃加热10～180 min 后冷却，得到谷氨酸—木糖MRI溶液。

1.2.2 MRI的表征和检测 将1.2.1得到的MRI溶液使用超高效液相色谱串联四极杆质谱联用仪(UPLC-ESI-MS)进行检测。色谱条件：色谱柱CSH C18(1.7 μm，2.1 mm×150 mm)；流动相为乙腈-0.1%甲酸；梯度洗脱程序为20 min内流动相2～100%线性梯度；流速0.3 mL/min；进样量1 μL；质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压3.5 kV；锥孔电压20 V；离子源温度100 ℃；去溶剂温度400 ℃；气流量700 L/h；锥孔气体流速50 L/h；碰撞能量为6 V；扫描范围m/z20～1 000，扫描时间1 s，扫描延迟0.1 s；探测器电压1 800 V。

MRI溶液通过半制备高效液相色谱进行纯化，色谱条件：Xbrige®BEH Amide (4.6 mm×250 mm，5 mm)色谱柱；流动相为乙腈-0.1%甲酸/超纯水-0.1%甲酸梯度洗脱；流速1 mL/min；进样量200 μL。纯化后的样品通过冻干后得到固体纯品，通过上述UPLC-ESI-MS及NMR进行定性分析。将纯化的后的MRI(纯度为98.33%)作为标准品用于后续样品的定量，通过计算不同浓度标准品的峰面积得到标准曲线：y=6.265 6x-1.052 2，R2=0.997 5。

1.2.3 MRI转化率随时间变化曲线的测定 将木糖和谷氨酸以2∶1的摩尔比溶于去离子水，调节pH至7，在90 ℃ 下加热10～190 min，每隔10 min取样，用UPLC-ESI-MS测定MRI峰面积，根据1.2.2中的标曲计算MRI浓度，通过MRI摩尔浓度与初始谷氨酸浓度百分比来计算MRI的转化率，以转化率为纵坐标，反应时间为横坐标作图，即可得到MRI转化率随时间变化的曲线。

1.2.4 反应物配比对MRI生成的影响 将木糖和谷氨酸以不同摩尔比(2∶1，1.5∶1，1∶1，1∶1.5，1∶2)溶于去离子水，调节溶液pH至7，分别于90 ℃反应140 min，冷却后测定MRI转化率，研究反应物配比对MRI转化率的影响。

1.2.5 溶液初始pH对MRI生成的影响 将木糖和谷氨酸以2∶1的摩尔比溶于100 mL去离子水后，将溶液pH分别调节为5，6，7，8，9，于90 ℃下反应140 min后立即冷却，测定MRI的转化率，研究溶液初始pH对MRI生成的影响。

1.2.6 真空脱水对MRI转化率的影响 根据MRI生成的临界条件，将木糖和谷氨酸以2∶1的摩尔比溶于去离子水，pH调至7，90 ℃下反应140 min后，使用旋转蒸发仪在85 ℃下分别脱水5，10，15，20 min，测定MRI转化率，研究脱水过程对MRI转化率的影响。

1.2.7 桃酥的制备 按上述条件得到MRI转化率最高的条件制备谷氨酸—木糖MRI样品，经冷冻干燥后得到粉末，按0.1%，0.3%，0.5%，0.7%(相对于面粉质量)的添加量添加到桃酥体系中，以未添加的体系作空白对照，研究不同MRI添加量对桃酥风味的影响。桃酥的制作参考汪晓琳等[12]的方法并将配方稍作修改：低筋面粉210 g，色拉油90 g，白砂糖70 g，鸡蛋液30 g，泡打粉2 g，小苏打1 g，添加MRI粉末的样品相应减少面粉的量。制作方法：原料混合，揉成面团，塑型，烤箱中200 ℃烤制15 min。

1.2.8 风味分析 使用顶空—固相微萃取(HS-SPME)—气相色谱串联质谱(GC/MS)技术分析挥发性风味物质。HS-SPME条件：样品粉碎后称取2.0 g于20 mL 顶空瓶中，加入饱和NaCl溶液3 mL及0.015 μg/μL 的1,2-二氯苯内标10 μL后立即密封。样品在50 ℃ 水浴平衡5 min后插入已老化的萃取头(75 μm；CAR/PDMS)于顶空瓶中距离样品上方1 cm左右处，萃取30 min后进样，进样口250 ℃，解吸7 min。GC/MS：采用DB-Wax毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，参考Pasqualone等[13]报道的检测曲奇饼干香气成分的方法。

1.2.9 感官分析 感官评定小组由20名经验丰富的感官评定员(20～50岁，8男12女)组成，感官评分标准见表1。

表1 桃酥感官评分标准Table 1 The sensory evaluation standards of walnut cookie

1.2.10 数据分析 使用SPSS 19.0进行显著性差异分析，数据存在显著性差异时P<0.05。GC/MS数据由Xcalibur软件处理，未知物质经计算机检索后与NIST谱库和Wiley谱库进行匹配。使用软件Excel 2016制表和绘图。

2 结果与分析

2.1 低温反应过程MRI转化率随时间变化曲线

通过测定MRI的浓度，研究在90 ℃加热谷氨酸—木糖溶液不同时间后MRI转化率的变化情况，结果如图1所示。

图1 低温反应时间对MRI转化率的影响Figure 1 Effect of low temperature reaction time on the conversion of MRI

从图1可以看出：谷氨酸—木糖MRI的转化率随着低温反应时间的延长逐渐增加，在140 min时达到最大(1.85%)，之后基本保持不变。由于随着加热时间的增加，MRI逐渐产生，同时也继续进行美拉德反应而被消耗掉，在140 min后MRI生成速率和消耗速率基本持平而达到动态平衡状态，因此MRI的转化率基本不变。

2.2 反应物配比对MRI转化率的影响

改变木糖—谷氨酸的配比(2∶1，1.5∶1，1∶1，1∶1.5，1∶2)后，MRI转化率的变化如图2所示。结果表明，木糖与谷氨酸的配比为2∶1时，MRI的转化率最大，作为反应底物，木糖的含量增多促进了谷氨酸的反应从而导致MRI转化率的提高。当谷氨酸的量多于木糖的量时，其MRI的转化率反而低于等摩尔比时的转化率，源于MRI转化率是按MRI与初始谷氨酸的摩尔比计算，即使谷氨酸增加会促进MRI的形成使其浓度增大，但按摩尔氨基转化率计算却不会使得MRI转化率增大。继续增加木糖的量可促进MRI形成，但对转化率并不会有较大提高，而剩余的木糖反而会造成浪费，增加成本，故选取木糖与谷氨酸的摩尔比为2∶1。

图2 反应物配比对MRI转化率的影响Figure 2 The effect of reactant ratio on the conversion of MRI

2.3 反应初始pH对MRI转化率的影响

图1中，谷氨酸—木糖MRI在加热到140 min时转化率达最大，但转化率仅为1.85%，由于在水相中美拉德反应是一个复杂的多级反应，还原糖和氨基酸脱水缩合生成席夫碱，再由席夫碱重排生成MRI，而MRI生成后随参与后续反应而消耗掉。据Ge等[14]的报道，MRI的形成遵循一级动力学方程且所需的活化能较大，而席夫碱的生成遵循二级动力学方程，MRI的生成不仅受反应底物浓度的限制，还受席夫碱的限制。同时，反应液初始pH也会影响MRI的转化率，改变不同初始pH，得到MRI转化率的变化如图3所示。MRI的转化率随着pH的升高而逐渐升高，pH为9时，转化率为2.2%，MRI转化率的提高不明显。Ge等[14]研究pH对Amadori化合物的转化率的影响也发现，当体系pH在2～10时，MRI的转化率随着pH的升高而逐渐提高，但当pH升至12时MRI的转化率大幅升高，这主要是因为形成席夫碱反应的亲核性。参与美拉德反应的是氨基而不是胺离子，碱性条件(pH >7)下，胺离子的质子被释放，增加了参与席夫碱形成反应的氨基酸的有效浓度。体系pH增加有利于席夫碱的形成，从而促进席夫碱向MRI转化。随着美拉德反应的进行，体系的pH值随之下降[15]，故仅调节体系的初始pH并不能对MRI的生成起到持续性的影响，从而导致调整初始pH并不能大幅度提高转化率，应尝试其他方法来提高MRI的转化率。

图3 初始pH对MRI转化率的影响Figure 3 Effect of initial pH on the conversion of MRI

2.4 真空脱水过程对MRI转化率的影响

由上述研究可知，反应时间、pH和反应物配比均会影响MRI的转化率，改变这些条件并不会对谷氨酸—木糖MRI的转化率有很大的提升。Cui等[16]报道过在水相中脱水过程可促进MRI的形成。因此，拟通过在常压水相反应后添加真空脱水过程提高MRI的转化率。在图1中，MRI在加热140 min后转化率达最高并随后趋于平稳，考虑在脱水的前期体系中水分含量变化不大，因而选择在MRI达到最大之前加入脱水过程，从而研究真空脱水过程对MRI转化率的影响。将谷氨酸—木糖溶液在90 ℃下反应130 min后，于85 ℃下研究脱水时间对MRI转化率的影响，结果如图4所示。

图4 脱水时间对MRI转化率的影响Figure 4 Effect of dehydration time on the conversion of MRI

结果表明，在真空脱水过程中，MRI转化率随着脱水时间的延长呈先升高再降低的趋势。据Beksan等[8]的研究，N-糖氨脱水生成席夫碱的反应为动态平衡。在真空脱水过程中，水被逐渐除去，导致化学平衡右移，席夫碱的大量生成促进其Amadori重排生成MRI并逐渐累积。同时，MRI继续进行美拉德反应而被消耗掉。在脱水的早期(0～15 min)，MRI的累积量大于其消耗量，转化率升高；在脱水反应的后期(15～20 min)，MRI的消耗量大于累积量，转化率逐渐下降。故85 ℃下最优的脱水时间为15 min，此条件下的转化率为75.11%。与不添加脱水过程而直接反应140 min后的转化率(1.85%)相比，脱水后MRI的转化率提高了39.6倍。

2.5 MRI添加量对桃酥挥发性风味物质形成的影响

利用常压热反应和真空脱水耦联得到MRI转化率最高的样品，以不同的比例(0.1%，0.3%，0.5%，0.7%)添加到桃酥体系中，与未添加MRI的样品对比，采用GC/MS研究MRI添加量对挥发性风味物质的影响，结果如表2、3所示。

空白和MRI添加量为0.1%，0.3%，0.5%，0.7%的桃酥样品中检测到的主要挥发性风味物质的种类分别为：20，28，29，27，27种(见表3)。由此可见，添加MRI后桃酥中挥发性风味物质种类有所增加，而添加MRI的量不同时风味物质的种类差别不大。

醇类物质阈值较高，对风味的贡献不突出。醛类物质阈值较低，添加MRI的桃酥与空白样品相比醛类物质总量差别不大。添加MRI的桃酥中苯甲醛的含量增大，可能是MRI中的木糖、二羰基化合物等与鸡蛋里的苯丙氨酸发生美拉德反应或Strecker降解反应，导致桃酥中苯甲醛的含量增大。苯甲醛具有苦杏仁味，含量过高时可能会影响桃酥的整体风味，故MRI添加过多时可能会影响桃酥整体风味。

酮类物质阈值较低，对风味的贡献较大，空白样品中未检出，仅在添加0.1%及0.3% MRI的桃酥中检出，其中含量较高的为2,3-戊二酮，具有奶香味，可能是添加的MRI经过美拉德反应生成的一种二羰基化合物；而MRI添加量较高时也未检出，可能是浓度提高后美拉德反应加剧，从而使二羰基化合物继续与氨基酸发生Strecker降解反应生成吡嗪而消耗掉。MRI添加量升高后，吡嗪类物质也随之升高的现象也验证了这一推测。

杂环类化合物如呋喃、吡嗪、吡咯等物质主要由氨基酸与还原糖之间的美拉德反应、氨基酸降解产生。其中，呋喃类化合物主要是通过MRI脱氨基形成脱氧糖酮后再脱水形成的，常见于烘焙食品中，为其提供了甜香、水果香、坚果香和焦香[17]。与空白相比，添加MRI的桃酥中呋喃类物质的总含量相对较高，这主要是由于额外添加的MRI受热可进一步反应生成呋喃类物质，使得添加MRI的桃酥中呋喃类物质含量较高。

吡嗪类具有较低阈值，具有坚果、焙烤等香气[18]，可显著增加面包、蛋糕、饼干等烘焙食品的香气[19]，主要由美拉德反应中生成的二羰基化合物与氨基酸发生Strecker降解产生。添加MRI的桃酥中检测到吡嗪的种类和数量都高于空白样品，说明MRI为桃酥增添了更丰富的焙烤香气；且随着MRI添加量增加，桃酥中吡嗪含量也升高。MRI热反应产生的二羰基化合物可与谷氨酸以及桃酥体系中其他游离氨基酸发生Strecker降解，使得吡嗪类物质种类增加；而添加MRI样品中还有未反应的木糖和谷氨酸等物质，还可在受热时继续发生美拉德反应而产生更多的挥发性风味物质，进一步说明MRI的添加可提高桃酥的焙烤香气。

表2 添加0.0%，0.1%，0.3%，0.5%，0.7% MRI的桃酥中的主要挥发性风味物质†Table 2 The major volatile compounds in walnut cookie with the MRI additionof 0.0%，0.1%，0.3%，0.5% and 0.7%

† ND表示未检出。

表3 添加0.0%，0.1%，0.3%，0.5%，0.7%MRI的桃酥中的主要挥发性风味物质汇总Table 3 Summary of major volatile flavor compounds in walnut cookie with the MRI addition of 0.0%，0.1%，0.3%，0.5% and 0.7%

吡咯类物质通常被描述为焦糖香，有类似爆米花的香气[20]，主要是通过美拉德反应或焦糖化反应产生。添加MRI的桃酥中均检测到3种吡咯类物质，而空白样品中未检出。

综上分析，通过对比添加MRI的桃酥和空白组样品，可发现谷氨酸—木糖MRI的添加并不会带来额外的异味，添加MRI的桃酥风味明显优于未添加的；MRI添加量较低时对风味提升效果不明显，而MRI添加量过高时可能会产生异味物质而影响桃酥整体风味。

2.6 感官分析

由表4的感官评定结果可知：对于各项感官指标，MRI的添加均会对桃酥的色泽、气味、口感、滋味产生影响。不同样品的形态评分之间无明显差别，说明MRI的添加对桃酥的形态无显著影响。桃酥的色泽评分随着MRI的添加呈先升高再降低的趋势，说明添加的MRI发生美拉德反应有利于桃酥形成良好的色泽，但添加量过多会使美拉德反应加剧、褐变加深而影响桃酥色泽评分。桃酥的气味感官分数也随着添加量增大而增大且显著高于未添加的样品，与GC/MS检测的挥发性风味物质含量的结果一致，说明MRI的添加可提升桃酥香气。对于桃酥的口感和滋味指标，感官评定的结果均是添加MRI的样品显著高于未添加的样品，但添加不同量的样品之间差别不显著。添加MRI影响桃酥的口感可能是添加的MRI在美拉德反应高级阶段产生二氧化碳等气体，使得桃酥的口感更酥脆。添加MRI的桃酥其感官评定总评分均高于空白样品，说明MRI的添加可提高桃酥的整体感官品质，且添加量为0.3%时综合感官评分最高。

表4 不同MRI添加量的桃酥感官评价综合评分†Table 4 Comprehensive scores of sensory evaluation for different MRI addition in walnut cookie

† 不同字母表示差异显著性(P <0.05)。

3 结论

利用谷氨酸—木糖水相美拉德反应制备MRI，通过优化反应物配比、初始反应pH及真空脱水方法提高水相中MRI转化率，将转化率从1.85%提高到75.11%。为研究MRI在实际烘焙食品中的增香效果，将不同量的MRI添加到桃酥中，通过GC/MS及感官评定的方法分析MRI对实际体系风味的影响。GC/MS结果表明MRI添加会增加挥发性风味物质的种类和数量，且风味物质数量随添加量增大而增大。结合感官评定结果分析，MRI添加量为0.3%时，对桃酥色泽和风味有较好贡献。上述研究结果可为以谷氨酸为原料制备MRI及其在烘焙食品中的应用提供一定参考。