UPLC-MS／MS法同时测定辛夷中12种木脂素

杨雁芸，张艳丽，何玉环，白志尧，郑晓珂，冯卫生

（1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心 河南 郑州 450046）

辛夷又名木笔花、毛辛夷，是木兰科落叶乔木植 物 玉 兰Magnolia denudataDesr.、望 春 花Magnolia biondiiPamp.或武当玉兰Magnolia sprengeriPamp.的干燥花蕾［1］，主产于河南、四川、湖北、浙江及安徽等地［2-3］。其性温味辛，具有散风寒、通鼻窍之功效，可用于治疗鼻塞、鼻炎、风寒头痛等［4-6］。辛夷中含有木脂素、黄酮、萜类及生物碱等多种化学成分，木脂素是其主要的一类活性成分［2，7-8］。研究显示，木脂素类化合物具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、血小板活化因子拮抗活性等多种药理作用［9-11］。

2015版 《中国药典》 对辛夷的质量控制标准为含木兰脂素不得少于 0.40%［1］，单一的化学成分难以全面保障和反映药材的品质及其有效性。因此，本实验采用UPLC-MS／MS 法同时测定辛夷中12种木脂素类成分的含有量，以期为提升辛夷及其制剂的质控标准提供参考和依据。

1 仪器与材料

ACQUITY 超高效液相色谱仪，配TQD 三重四级杆质量分析器和Masslynx4.1 色谱工作站（美国Waters 公司）；AB135-S 型电子分析天平（十万分之一，瑞士 Mettler Toledo 公司）；XK80-A 型快速混匀器（江苏新康医疗器械有限公司）；CENRIFUGE 5810R 离心机（德国 Eppendorf 公司）；SB-5200DTD 型超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

对照品桉脂素（含有量98.36%）、木兰脂素（含有量94.52%）、epimagnolin（含有量95.83%）、里立脂素B 二甲醚（含有量96.54%）、落叶松树脂醇-4′-O-β-D-葡萄糖苷（含有量90.83% ）、7R∗，8S∗-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol-4-O-β-D-glucopyranoside（DAG，含 有 量99.43% ）、4，4′-dimethoxy-3′-hydroxy-7，9′：7′，9-diepoxylignan-3-O-β-D-glucopyranoside（DHDG，含有量 90.72% ）、3′，4-O-dimethylcedrusin（含有量 98.88%）、松脂醇（含有量 90.99%）、fargesol（含有量95.26%）、辛夷脂素（含有量97.91%）、conicaoside（含有量92.87%），均由本实验室前期分离制备所得，1H，13C-NMR 和MS 数据均与文献报道［12-20］一致，含有量经高效液相色谱（面积归一化法）检测所得。甲醇、甲酸（均为色谱级，美国Fisher 公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。4 批辛夷药材购于郑州各大药店，批号分别为 20140609、170501、170201、161206，经河南中医药大学董诚明教授鉴定均为望春花Magnolia biondiiPamp.的干燥花蕾。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取适量的各对照品，分别置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解后定容至刻度，摇匀即得各木脂素类成分的单一对照品贮备液。精密量取上述对照品溶液，加60% 甲醇水溶液，稀释配制成含桉脂素 3 600 μg／mL、木兰脂素1 030 μg／mL、epimagnolin 2 160 μg／mL、里立脂素B 二甲醚 1 940 μg／mL、落叶松树脂醇-4′-O-β-D-葡萄糖 苷 62.7 μg／mL、DAG 8.3 μg／mL、DHDG 20.6 μg／mL、3′，4-O-dimethylcedrusin 170 μg／mL、松脂醇 79.4 μg／mL、fargesol 570 μg／mL、辛夷脂素 530 μg／mL、conicaoside 14 μg／mL 的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 取辛夷药材，分别打粉并过3 号筛后得药材粉末。精密称取0.5 g 药材粉末，置入100 mL 具塞锥形瓶中，加入60%甲醇水溶液50 mL，密塞，称定质量，超声（功率200 W，频率 40 kHz）提取 1 h，冷却至室温，再次称定质量后用60% 甲醇水溶液补足减失的质量，摇匀，12 000 r／min 离心 10 min，取上清液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取滤液即得。

2.2 色谱条件 Waters BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相 0.1% 甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～1 min，10%～40% B；1～3 min，40%～60% B；3～7 min，60%～100% B）；体积流量 0.2 mL／min；柱温 30 ℃；进样量 2 μL。

2.3 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）；正负离子切换扫描；毛细管电压 3.5／2.5 kV；离子源温度200 ℃；脱溶剂气温度350 ℃；脱溶剂气体积流量500 L／h；雾化器压力3.0 V；检测模式多反应离子监测（MRM）。12种木脂素的质谱分析条件参数见表1，提取离子流色谱图见图1。

表1 各成分质谱参数Tab.1 MS parameters of various constituents

图1 各成分离子流色谱图Fig.1 Ion current chromatograms of various constituents

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系、检出限和定量限 取混合对照品溶液，用60%甲醇水溶液逐级稀释配制成6 个不同质量浓度的混合对照品溶液，在 “2.2”和“2.3”项条件下进样，以各木脂素成分质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。信噪比S／N=3 时对应的质量浓度作为检测限，S／N=10 时对应的质量浓度作为定量限。结果见表2，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.2 精密度试验 精密吸取线性中间点质量浓度的混合对照品溶液，在 “2.2”和 “2.3”项条件下，分别连续进样6 次，记录12种木脂素成分的峰面积，计算相对标准偏差RSD≤3.07%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取6 份同一批次的辛夷药材（批号170201），按 “2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.2”和 “2.3”项条件下进样，计算12种木脂素成分含有量的RSD≤3.17%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取批号为170201 辛夷药材的供试品试液，在 “2.2”和 “2.3”项条件下，于配制后 0、2、4、8、12 和 24 h 进样，测得各木脂素成分的峰面积，计算其RSD≤2.59%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取9 份已知各木脂素成分含有量的辛夷药材粉末（批号170201），每份0.5 g，分别精密加入对照品贮备液，使加入量为样品中各成分含有量的80%、100%、120%，按 “2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.2”和 “2.3”项条件下测定各成分含有量，计算加样回收率，平均加样回收率为 98.76%～102.32%，RSD 1.89%～2.58% 。

2.5 样品含有量测定 取各批次厂家的辛夷药材，按 “2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，在“2.2”和 “2.3”项条件下分析，计算各批次辛夷药材中各成分的含有量，结果见表3。采用 SPSS 19.0 软件对测定结果进行箱线图分析，箱线图是引入P值来评价不同批次间的差异（P=每个批次各化合物含有量／各批次各化合物的平均含有量×100%），P值越接近100% 表明批次间差异越小。结果见图2，表明4 和12 2种成分批次间差异较大，其余成分P值均在75%至125%之间，差异波动在可接受范围内。

表3 各成分含有量测定结果（mg／g， n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g， n=3）

图2 各成分箱线图Fig.2 Box chart of various constituents

3 讨论

在优化提取条件时，本实验考察了不同溶剂（乙醇、甲醇、乙腈）、不同体积分数（30%、60%、100%）以及不同提取时间（0.5、1、1.5 h），结果表明以60%甲醇水溶液超声提取1 h，提取效率较高。

在优化色谱条件时，通过改变流动相（水、甲醇、乙腈）不同的组成比例，并添加不同电解质（甲酸、乙酸、甲酸铵），发现以 0.1% 甲酸水溶液-甲醇为流动相进行梯度洗脱时，峰形最佳，在7 min 内可完成12种木脂素类成分的含有量测定。

辛夷中木兰脂素的含有量远高于其他成分，桉脂素、epimagnolin、里立脂素 B 二甲醚、3′，4-O-dimethylcedrusin 和辛夷脂素的含有量较高，落叶松树脂醇-4′-O-β-D-葡萄糖苷、7R∗，8S∗-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol-4-O-β-D-glucopyranoside、4，4′-dimethoxy-3′-hydroxy-7，9′：7′，9-diepoxylignan-3-O-β-D-glucopyranoside、松 脂 醇、fargesol 和conicaoside 的含有量较低。不同批次间12种成分的含有量具有一定波动，分析与其药材的生长环境、采收时间以及贮存条件等多种因素相关。

本实验建立的 UPLC-MS／MS 法可快速、准确地同时测定辛夷中12种木脂素类成分的含有量，MRM 检测模式与传统的液相色谱相比，具有更高的选择性和灵敏度，并且待测化合物无需完全分离即可进行同时准确定量。以期为提高辛夷药材以及含辛夷中成药的质量标准提供参考，也为辛夷中木脂素类成分的进一步研究奠定基础。