ECT2-siRNA转染对肺腺癌A549细胞周期分布和凋亡的影响

吴 昊，林 庆，徐 全，柳阳春，陈立如，尹 随

江西省人民医院心胸外科 南昌 330000

肺癌是一种常见的呼吸系统恶性肿瘤，是所有恶性肿瘤里发病率最高，造成癌症死亡最多的疾病[1]；非小细胞肺癌是肺癌常见的病理类型，约占80%[2]，其中又以肺腺癌最常见。我国是肺癌的高发区，然而，目前传统的手术治疗、放疗和化疗治疗肺癌的效果并不理想[3]。近年来，随着医学技术的不断发展，基因治疗已成为肺癌研究中的热门课题。探讨肺癌发生发展的分子机制，寻找有效的治疗靶点对治疗肺癌具有重要意义。

上皮细胞转化序列2(epithelial cell transforming sequence 2 oncogene,ECT2)最早在小鼠NIH/3T3细胞中发现，可通过调控Rho GTP酶介导上游小G蛋白家族成员的表达，调控细胞周期[4]。人类ECT2基因定位于人3q26染色体上，可编码883个氨基酸。有报道[5-8]证实，ECT2是一种与细胞增殖和凋亡有关的癌基因，在结直肠癌、胶质瘤和胃癌等多种肿瘤组织中异常高表达，与肿瘤的发生发展关系密切。本研究探讨沉默ECT2表达对肺腺癌A549细胞周期分布和凋亡的影响，以期进一步阐明ECT2在肺腺癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1细胞与试剂A549细胞(上海生命科学研究院细胞资源中心)，RPMI 1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)，青霉素、链霉素和Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)，兔多克隆抗体P53、鼠单克隆抗体CyclinD1和鼠多克隆抗体β-actin(美国Santa Cruz公司)，兔抗ECT2多克隆抗体、兔抗Cleaved Caspase-3多克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG(美国Abcam公司)，凋亡检测试剂盒(美国BD公司)，细胞周期检测试剂盒(南京凯基公司)，BCA试剂盒(北京康为世纪生物公司)。ECT2-siRNA及其阴性对照序列NC-siRNA由上海吉玛制药技术公司设计合成。

1.2细胞培养冻存A549细胞经水浴解冻复苏后，用含体积分数10%胎牛血清和青-链霉素双抗的RPMI 1640培养基于37 ℃、体积分数5%CO2的细胞培养箱内培养。显微镜下监控细胞生长情况。当细胞生长至75%融合时，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。选取处于对数生长期的细胞用于实验。

1.3实验分组与处理将A549细胞分为空白组、阴性对照组(转染阴性对照NC-siRNA)、干扰组(转染ECT2-siRNA)。转染前24 h，将A549细胞以每孔3×104个接种于6孔板，置于细胞培养箱内常规培养。当细胞生长至70%融合时，参照转染试剂说明书根据实验分组进行转染，其中siRNA终浓度为20 μmol/L。细胞转染48 h后，收集各组细胞进行后续实验。

1.4ECT2-siRNA干扰的效果采用Western blot检测ECT2蛋白的表达。A549细胞中加入细胞裂解液提取总蛋白，BCA法定量总蛋白后，以每孔60 μg的上样量行SDS-PAGE凝胶电泳，电转至PVDF膜上。采用含50 g/L脱脂奶粉的封闭液封闭1.5 h后，加入ECT2(按1∶500稀释)和β-actin(按1∶1 000稀释)抗体，4 ℃下孵育过夜。封闭液洗膜后，加入1∶2 000稀释的HRP标记的二抗，37 ℃下孵育1 h。经化学发光剂显色后，用凝胶图像处理软件分析条带的灰度值。目的蛋白的相对表达量=目的条带灰度值/内参条带灰度值。实验重复3次。

1.5细胞周期的检测收集转染48 h的各组细胞，经预冷磷酸缓冲液重悬细胞后，以预冷的体积分数70%的乙醇固定30 min。加入染色液(含RNase和PI)染色20 min后，上流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.6细胞凋亡的检测收集转染48 h的各组细胞，以预冷磷酸缓冲液洗涤3次后，加入200 μL结合缓冲液重悬细胞，再加体积各为5 μL的Annexin V-FITC和PI避光处理15 min，补加结合缓冲液300 μL，上流式细胞仪检测细胞凋亡。实验重复3次。

1.7细胞周期和凋亡相关蛋白表达的检测采用Western blot检测细胞周期蛋白CyclinD1，凋亡相关蛋白P53和Cleaved Caspase-3(一抗分别按1∶500、1∶500和1∶1 000稀释)的表达，具体步骤参照1.4。

1.8统计学处理采用SPSS 22.0处理数据，3组间以上指标的比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1ECT2-siRNA干扰效果结果见图1。空白组、阴性对照组和干扰组细胞中ECT2蛋白的表达水平分别为(0.72±0.05)、(0.75±0.06)和(0.13±0.02)，3组间相比，差异有统计学意义(F=169.246，P<0.001)；与空白组和阴性对照组相比，干扰组ECT2蛋白的表达水平降低(P<0.05)。

1～3组：分别为空白组、阴性对照组和干扰组

2.23组细胞周期分布比较与空白组和阴性对照组相比，干扰组G0/G1期细胞百分比升高，S期和G2/M期细胞百分比降低(P<0.05)；而阴性对照组与空白组G0/G1期、S期和G2/M期细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

2.33组细胞凋亡率比较与空白组和阴性对照组相比，干扰组细胞的凋亡率升高。见表1。

表1 3组细胞周期分布和细胞凋亡率比较(n=3) %

*:与其他2组相比，P<0.05

2.43组细胞CyclinD1、P53和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平的比较与空白组和阴性对照组相比，干扰组P53和Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平升高，而CyclinD1蛋白的表达水平降低(P<0.05)。见图2、表2。

1～3组：分别为空白组、阴性对照组和干扰组

表2 3组细胞CyclinD1、P53和Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平(n=3)

*:与其他2组相比，P<0.05

3 讨论

研究[9-11]表明，ECT2是一种与肺癌、乳腺癌和前列腺癌等多种恶性肿瘤发生发展密切相关的癌基因，其在肿瘤组织中表达水平越高，患者的预后越差。Iyoda等[12]研究指出，ECT2在口腔鳞状细胞癌组织和细胞中表达上调，下调其表达后可通过上调p21、p27和下调CyclinD1、CyclinE、CDK4导致细胞周期阻滞于G1期，进而抑制细胞增殖。Xu等[13]研究发现ECT2可被miRNA-223靶向调控，下调其表达可诱导p21表达，改变Cyclin D1-CDK复合物的活性，将细胞阻滞于G1期，影响骨肉瘤细胞周期进展。Xie等[14]进一步发现下调ECT2能有效抑制骨肉瘤OS细胞增殖，诱导细胞凋亡，并通过下调MMP-2和MMP-9表达抑制OS细胞侵袭和迁移。另外，沉默乳腺癌细胞中ECT2表达后可通过ERK/miR-101/Rac1信号转导通路抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡[15]。可见，ECT2可通过多种机制参与细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡等过程，在肿瘤发生发展过程中发挥重要的调控作用。

细胞周期是一个高度有序的运转过程，其调控紊乱是肿瘤细胞失控性增殖进而导致肿瘤发生的重要原因[16]。除了细胞异常增殖外，肿瘤细胞发生凋亡的倾向和能力降低也是肿瘤发生发展的重要机制，诱导细胞凋亡正逐渐成为一种发展中的肿瘤治疗手段[17]。本研究结果显示，ECT2-siRNA可沉默肺腺癌A549细胞中ECT2的表达；ECT2沉默后A549细胞被阻滞于G0/G1期，细胞凋亡率升高；进一步检测发现，CyclinD1蛋白的表达水平降低，而P53和Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平升高。CyclinD1是细胞周期蛋白依赖性激酶的重要调控者，在细胞由G1期进入到S期中发挥推动作用；此外，CyclinD1也是公认的原癌基因，其过度表达可致细胞增殖失控[18]。P53是一种重要的细胞转录调节因子，也是一种重要的抑癌基因，其表达增多可使细胞周期停滞于G1期并介导细胞凋亡[19-20]。Caspase-3处于凋亡级联反应的下游，是细胞凋亡过程中的主要效应因子，其活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的重要标志[21]，其中Cleaved Caspase-3是其重要的活化形式。本研究结果提示，沉默ECT2可通过下调CyclinD1和上调P53、Cleaved Caspase-3的表达诱导A549细胞周期阻滞和凋亡。

综上所述，靶向沉默ECT2表达可诱导肺腺癌A549细胞周期阻滞和凋亡，而CyclinD1蛋白表达下调和P53、Cleaved Caspase-3蛋白表达上调可能是ECT2抑制肺腺癌发生发展的重要机制。该结果进一步阐明了ECT2在肺癌发生发展中的作用，ECT2有望成为肺癌治疗的新靶点。