河南省结核分枝杆菌MIRU-VNTR和间隔区寡核苷酸分型分析

石 洁，郑丹薇，朱岩昆，马晓光，王少华，李 辉，张国龙

河南省疾病预防控制中心 郑州 450016

结核病是严重威胁人类健康的公共卫生问题，尤其是发展中国家。尽管世界卫生组织在2017年提出了“终止结核病”的目标，但我国每年新发结核病约90万例，是全球第三大高负担国家，特别是耐多药结核病疫情较重[1]。河南省作为中国人口最多的省份，结核和耐多药结核患者数均多于其他省份，近年来平均发病率为81/10万[2]。目前针对河南省结核分枝杆菌分子流行病学的研究较少，亟需对河南菌株进行分型分析。

制定一套合适的分型方法对于结核病的防控有重要的意义，可调查结核病的传播模式，追踪结核病的传播，监测可疑的结核病暴发[3]。间隔区寡核苷酸分型(spoligotyping)是通过检测结核分枝杆菌基因组中43个同向重复序列是否缺失进行分型的方法，是鉴定北京家族基因型的金标准[4]。分枝杆菌散在重复单元-数目可变串联重复序列(mycobacterium interspersed repetitive unit-variable number tandem repeat，MIRU-VNTR)分型是另一种结核分枝杆菌分型方法，其根据不同位点散在重复单位数目的不同进行分型[3,5]。这两种方法均操作简单，结果可数字化，重复性较好，具有较好的经济效益，二者结合后对结核分枝杆菌具有较高的分辨力。以往研究[6-7]表明，除了传统24位点外，ETRF和Mtub38这两个位点对于我国结核分枝杆菌的分型有较高的分辨力。本研究使用Spoligotyping和26位点(标准24位点和ETRF、Mtub38)MIRU-VNTR方法评价了河南省结核分枝杆菌的基因多态性，并将26位点的检验效能与标准24位点、15位点和12位点相比较。

1 材料与方法

1.1菌株来源和试剂对本实验室冻存的2015年间来自河南不同地区肺结核病患者的临床分离株进行复苏培养，排除培养失败菌株，共计纳入668株。结核病患者的纳入标准参照《中国结核病防治规划实施工作指南》。以结核分枝杆菌标准株H37Rv作为对照菌株。使用康为世纪的2×Taq Plus MasterMix进行PCR扩增。商品化杂交膜购自Isogen Bioscience 生物公司(荷兰)。

1.2基因组DNA的提取刮取一环结核分枝杆菌培养物重悬于300 μL TE缓冲液中，于85 ℃灭活，沸水浴加热5 min后，12 000×g离心5 min，取上清备用。

1.3Spoligotyping使用商品化的杂交膜对所提取的菌株基因组DNA进行Spoligotyping[8]。使用生物素标记的引物Dra(5’-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3’)和Drb(5’-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3’)扩增结核杆菌的同向重复区域，将PCR扩增产物与共价结合有43个寡核苷酸探针的膜杂交。杂交膜用含有0.5% SDS的SSPE缓冲液洗涤后，与过氧化物酶反应30 min。使用ECL化学发光显色液检测并判读结果。分型结果以八进制编码显示，并与国际Spoligotyping数据库SITVIT2进行比对，确定样本菌的家族类型和Spoligotype国际编码(Spoligotype international type，SIT)[9]。为描述基因簇间的遗传关联，应用Bionumeric6.6构建最小生成树，其中每个结点代表一个单独的基因型，每个结点大小取决于每种基因型中的菌株数目[10]。

1.4MIRU-VNTR分型为进一步确定菌株的遗传学关系，我们采用26位点MIRU-VNTR分型，包括传统24位点和其他2个位点(ETRF和Mtub38)。参照文献[6]设计引物,对每个位点分别进行PCR扩增。根据每个位点的侧翼和重复序列的长度计算串联序列的重复数。以H37Rv作为对照菌株，以无菌水的扩增产物用来判断是否存在交叉污染。分型结果用字符数据形式表示，并用Bionumeric6.6进行分析。使用Hunter-Gaston分辨力指数(HGDI)评价每个位点的分辨能力。

2 结果

2.1Spoligotyping结果668个菌株共分成了35个不同的基因型。8株的SIT与SpolDB 4.0数据库及其升级版本SITVIT两个数据库中所有已鉴定菌株均不匹配，因此被定义为未知菌株。北京型家族基因型菌株有558(83.53%)株，其中546株为典型北京型家族基因型(SIT1)，表现为前34个间隔区缺失，只存在35～43个间隔区[11]；剩余12株由于缺失1个或多个在经典北京型家族存在的间隔区，被定义为类北京型菌株或非典型北京型菌株。其次是T1家族基因型和MANU2基因型，分别有59(8.83%)株和20(2.99%)株。北京型和T1、MANU2基因型是该地区主要流行菌株，占总体菌株的95.35%。其余的110株非北京型菌株被分为28个基因型。668株通过成簇分析最终被划分为10个簇，25个菌株具有独特的Spoligotype基因型。由于Spoligotyping对北京型家族分辨能力差，成簇率较高，达94.7% (表1)。

最小生成树结果表明北京型和非北京型菌株分别构成了2个大基因簇。最大的簇含有546株典型北京型家族菌株，而非典型北京型菌株组成的小簇围绕在该簇周围。右边第二大基因簇主要含有T1和MANU2家族和其他非北京型家族，而8个未知基因型位于该簇周围，提示未知基因型菌株在进化亲缘关系上可能与非北京型家族更接近(图1)。

表1 668株结核分枝杆菌Spoligotyping结果

续表1

图1 根据668株菌的Spoligotyping结果构建的最小生成树

2.2MIRU-VNTR分型结果26位点MIRU-VNTR分析结果表明，139株被分成38个簇，最大的簇含有15株，成簇率为15.1%；其余529株表现为独立基因型。但Spoligotyping和MIRU-VNTR北京型菌株的分型结果存在略微偏差，MIRU-VNTR最大的簇主要包含北京型家族菌株，但其中有33株为非北京型家族菌株。

2.3MIRU-VNTR和Spoligotyping对河南菌株的分辨能力为评估MIRU-VNTR不同位点组合的分辨能力，我们比较了26位点与标准24位点、15位点和12位点之间以及结合Spoligotyping后的分辨性能(表2)。26位点、标准24位点和15位点与原始12位点组合相比, 尤其与Spoligotyping组合后,对所有菌株的分辨效能显著提高。

表2 不同分型方法的分辨性能

通过逐个增加VNTR位点评价累积HGDI值。最终鉴定出10个辨别能力最强的位点，分别为Qub11b、mtub21、miru26、qub26、mtub04、miru10、ETRF、ETRE、miru39和ETRA，其累积HGDI达到0.996，与26位点的HGDI相近，进一步增加其他位点没有明显改善累积HGDI值(表3)。

表3 逐个增加MIRU-VNTR位点的累积HGDI

3 讨论

河南省是结核病高发地区，但对该地区结核杆菌的分子特征的研究较少。本研究首次利用两种广泛使用的分型方法，Spoligotyping和MIRU-VNTR，对河南省结核杆菌基因多态性进行了研究。北京家族基因型是结核杆菌东亚谱系中最重要的基因型。该基因型是我国主要的流行菌株，而且在我国北部的比例大于南部。北京家族基因型在北京地区占82.0%～96.3%[12]，而在南部如广东、广西和福建等地流行率较低(25%～55.3%)[13]。在本研究中83.5%的结核杆菌属于北京家族基因型，表明该基因型是河南省优势菌株，这与上述研究结果一致。北京型家族在北方较高的流行可能与该地区由气候影响的习俗相关[14]。本研究也鉴定出8株新的Spoligotyping类型。小基因簇的大量存在提示了近期传播的可能性。本研究结果表明北京家族菌株基因成簇率明显较高，表明其可能是河南省结核分枝杆菌近期传播的优势菌株。

尽管Spoligotyping能够对结核分枝杆菌进行有效分型，但它对北京家族菌株分辨能力较差。本研究将668株菌成功分为35个不同的基因型，包括10个簇和25个独特Spoligotype。由于Spoligotyping的分辨力较低，我们使用另一种分子分型方法MIRU-VNTR进一步分析这些菌株的分子特征[15-16]。对于北京家族分型关键在于选择合适的VNTR位点。由于结核分枝杆菌种群结构存在差异，并不需要在任何情况下均使用所有24位点组合。不同的调查地区，VNTR位点不同造成了分型效能的差异。为鉴定出一套适合河南结核分枝杆菌的VNTR位点组合，我们参照之前的研究首先选择26个位点组合对668株临床样本进行VNTR分型，得到了567个基因型, 包括38个簇和529个独特的基因型，HGDI为0.998。对于北京家族而言，26位点的成簇率(16.12%)明显低于Spoligotyping(98.74%)。对所有的临床标本而言，26位点的HGDI(0.998)明显高于Spoligotyping(0.042)。VNTR的成簇率在北京型和非北京型之间存在差异(16.13%vs. 2.7%)，表明在河南地区北京家族可能具有更强的传染能力。Spoligotyping和26位点组合后，可将所有668株菌分成576个基因型，但二者组合的成簇率低于26位点的成簇率。

本研究中Spoligotyping和MIRU-VNTR分型结果存在不一致性。33株虽然Spoligotype判定为非北京基因型，但MIRU-VNTR分析显示它们的分子特征更接近北京家族。19株Spoligotyping鉴定为北京家族，但VNTR分型表现出非北京家族基因型的特性。这种差异可能是样本中存在多种结核分枝杆菌的混合感染所致。迄今为止，没有一种基于分子标记的分型方法能完全准确地区分北京家族[17]。

综上所述，本研究首次报道了河南省结核分枝杆菌的基因型特征；北京家族基因型为河南省的优势菌株；选择合适的VNTR位点有助于针对特定地区结核分枝杆菌的分型；我们的结果鉴定出一套精简的10位点MIRU-VNTR组合可用于本地区大部分结核分枝杆菌的分型，该方法的应用将有助于增强河南省结核病的防控，降低河南省的结核病负担。