Cry1Ia蛋白的表达与纯化

郭小琴，钱红梅，郭 星，高佳丽，张义茹，高建华，王兴春

（1.山西农业大学生命科学学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学农业生物工程研究所，山西 太谷 030801）

革兰氏阳性菌苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在自然界中分布广泛，如在土壤、植物、昆虫、污水、储藏物和灰尘中都可以分离得到[1-2]。Bt 能够表达特异性杀虫蛋白，包括杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins，ICPs）[3]、营养期杀虫蛋白（vegetative insecticidal proteins，VIPs）[4]及分泌型杀虫蛋白（secreted insecticidal proteins，SIPs）[5]。其中，杀虫晶体蛋白分为Cry（Crystal Protein，晶体毒素）和Cyt（Cytolitic Protein，细胞裂解素）2 种，而Cry1I 类蛋白是Cry 蛋白家族的一个特殊分支[6-7]，含有 Cry 蛋白典型的 N 端 3 个结构域（I，II 和 III），这3 个结构域具有不同的功能。其中，结构域I 用于形成跨膜通道；结构域II 和III 负责受体的识别与结合[8-10]。

通常，具有经典3 个结构域的Cry 蛋白有2 种大小[6]。其中，一类是在结构域的C 端存在几乎与之等长的长肽，这类Cry 蛋白的分子量约135 ku，比如Cry1A，Cry9 等；另一类Cry 蛋白不具有C 端长肽，分子量远小于前者，比如Cry1I 蛋白等，Cry1I 蛋白分子量约81 ku，可以分为7 个亚类（Cry1Ia，Cry1Ib，Cry1Ic，Cry1Id，Cry1Ie，Cry1If 和 Cry1Ig 等），每种亚类中，又包括若干种蛋白，比如Cry1Ia 包括约 38 种已知蛋白（Cry1Ia1～Cry1Ia38）。

Cry1I 是Cry 蛋白中少有的分泌型蛋白，其跨膜分泌由N 端分泌信号肽介导。该蛋白在天然宿主Bt 细胞中表达后，不形成伴孢晶体[11]。

Cry1I 蛋白对鳞翅目和鞘翅目部分昆虫具有杀虫活性[12]，具有良好的应用潜力。比如Cry1Ie 蛋白对小菜蛾（Plutella xylostella）[13]、棉铃虫（Helicoverpa armigera）[14]、亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）[15]等具有较好的杀虫活性，表达Cry1Ie 的转基因烟草[16]、玉米[16]和棉花[17]等也相继报道。

本研究将一种cry1Ia 基因接入pET28aDel 载体[17]，构建表达质粒，并利用该质粒在大肠杆菌中表达Cry1Ia，旨在对Cry1Ia 蛋白的表达条件进行摸索，并与Bt 细胞的表达进行比较，建立Cry1Ia 蛋白的纯化条件，为进一步研究Cry1I 类蛋白奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

研究涉及的菌株为大肠杆菌（Escherichia Coli）TG1 菌株 Tp304-1Ia 和 Bt 菌株 Bp304-1Ia。2 种菌株均含有 304-P1IaT 质粒[18]。

研究涉及的分子生物学试剂包括：Takara Premix Taq（货号 RR003A，用于 PCR 反应）、Takara pMD19 载体（货号 6013，用于 TA 克隆）、Axygen 质粒小量制备试剂盒（货号AP-MN-P-50）；Axygen DNA 纯化回收试剂盒（货号AP-GX-50）；金斯瑞Ni-NTA 亲和层析介质（货号L00250）。

1.2 试验方法

1.2.1 表达载体的构建 将Tp304-1Ia 菌株在37 ℃，200 r/min 条件下过夜培养。分别取2 mL 菌液至离心管，12 000 r/min 离心3 min，收集细胞沉淀，并提取质粒，作为PCR 的模板。使用引物1Ia-bbF（5′-GG ATCCACCATGAAACTAAAGAATCAAGATAAG）和1Ia-petR（5′-GCAAGCTTCATGTTACGCTCAATATG GAGTTG）进行PCR 反应，获得Cry1Ia 的编码序列，并进行TA-克隆。测序正确后，将目的片段用BamHI和HindIII 切出，接入pET28aDel 质粒相应的位点。将正确的质粒命名为p28D-cry1Ia。将构建好的表达质粒转入BL21（DE3）star 菌株，获得BLp28D-cry1Ia 菌株。

1.2.2 Cry1Ia 蛋白的表达与SDS-PAGE 分析 挑取BLp28D-cry1Ia 菌株的单克隆，在液体LB 培养基中培养 12 h（含 50 μg/L 的卡那霉素，37 ℃，200 r/min）后，按 1∶100（V∶V）的比例转接至 200 mL 液体培养基，继续培养至OD600值为0.6～1.0。加入终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG，在 28 ℃诱导表达 4，8 h。

将上述培养液离心，收集细胞，弃上清。将细胞沉淀用 20 mL 预冷的 PBS 缓冲液（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4和 2 mmol/L KH2PO4，pH 值为 7.4）重悬，超声波处理 30 min，12 000 r/min 离心20 min，将上清与沉淀分离。将沉淀用等体积的PBS 缓冲液重悬。分别取160 μL 上清和沉淀重悬液，加入 40 μL 的 5×Loading Buffer，混匀后，沸煮 10 min。12 000 r/min 离心 5 min，上样，进行SDS-PAGE 检测。

将Bp304-1Ia 菌株划板，挑取单克隆。在含有25 μg/L 红霉素的 LB 培养基中培养 72 h（25 ℃，200 r/min）。取2 mL 菌液离心，分离上清和细胞沉淀。然后制备SDS-PAGE 样品，并进行电泳分析。

1.2.3 Cry1Ia 蛋白的纯化 按照说明书的步骤，将大肠杆菌表达产物的可溶部分，通过Ni-NTA 层析介质，并用含有不同浓度咪唑的洗脱缓冲液依次洗脱，收集穿过液，并进行SDS-PAGE 检测。

2 结果与分析

2.1 cry1Ia基因的表达载体构建

对p28D-cry1Ia 质粒进行双酶切（BamHI 和HindIII）鉴定，结果显示，目的基因大小与304-P1I-aT 质粒中的 cry1Ia 基因相同（BamHI 和 SacI），说明载体构建正确（图1）。

2.2 Cry1Ia蛋白的表达

在不同的时间点，BLp28D-cry1Ia 均能够诱导表达Cry1Ia 蛋白，但是，8 h 的表达产物积累更多，尤其是2 号克隆（图2-A）。SDS-PAGE 结果显示，Bt 菌株也可表达Cry1Ia 蛋白，但是主要以不可溶的形式表达，上清中未观察到相应的条带（图2-B）。另外，大肠杆菌中的表达产物明显高于Bt 菌株。

2.3 Cry1Ia蛋白的纯化

选择BLp28D-cry1Ia 菌株2 号克隆的表达产物，取可溶部分使用Ni-NTA 进行纯化，结果显示（图3），成功纯化到Cry1Ia 蛋白，该蛋白在含有60 mmol/L 咪唑的洗脱液中开始从固定相上脱落，但是比例较小；90 mmol/L 以上的咪唑浓度能够更好地洗脱Cry1Ia 蛋白，其中，250 mmol/L 的咪唑浓度是Cry1Ia 蛋白的最优洗脱浓度。

3 结论与讨论

本研究构建了Cry1Ia 蛋白的表达载体，用于在大肠杆菌中表达这种蛋白质，初步研究发现，在大肠杆菌中该蛋白能够获得较好的表达，且随着表达时间的延长，表达量增加。

Bt 细胞中Cry1Ia 蛋白的产量相对较少。由于Cry1Ia 属于分泌蛋白，因此，可能有部分表达产物翻译后分泌至胞外，从而导致细胞内积累较少。Cry1Ia 蛋白分泌后，会迅速被蛋白酶消化，主要以60 ku 抗消化核心的形式存在[12]。因此，要获得表达量可观且序列完整的Cry1Ia 蛋白，革兰氏阴性菌如大肠杆菌是较理想的选择。

本研究通过对Cry1Ia 蛋白纯化条件的摸索，结果发现，该蛋白在稍低的咪唑浓度（60 mmol/L）下就能够被洗脱，但此时的非特异性条带依然较多；而通过稍高浓度咪唑（90，125 mmol/L）的洗脱能够进一步去杂；利用250 mmol/L 的咪唑能够将大部分靶标蛋白洗脱。因此，在后期纯化时，可以直接用30 mmol/L 的咪唑充分洗脱去杂；然后用90 mmol/L的咪唑进一步洗脱去杂；最后用250 mmol/L 的咪唑收集Cry1Ia 蛋白。

本研究构建了Cry1Ia 蛋白的表达体系，并探索了该蛋白的纯化条件，为进一步研究这类杀虫蛋白奠定了基础。