抗除草剂转基因普通白菜的获得和检测

胡 毅，付 超，2，王雪婷，侯雷平，李梅兰

（1.山西农业大学园艺学院，山西 太谷 030801；2.太原市小店区农业委员会，山西 太原 030032）

普通白菜（Brassica rapa ssp.chinensis Makino）原产于我国，是十字花科芸薹属中的一种重要蔬菜，营养丰富，在全国各地均有栽培。目前，通过组织培养进行遗传转化的体系已经日渐成熟，但是由于白菜携带不易再生的AA 基因型[1-2]，其转化难度比较大，而且采用组织培养的方式进行遗传转化除了需要较长的试验周期外[3]，通过组织培养得到的植株非常容易产生体细胞突变，并且其后代的育性大大下降[4]。而随着植物稳定遗传转化技术日趋完善，近几年兴起的蘸花转化具有操作简单、转化率高、重复性强等优势，可以减少获得纯合后代的时间，并且大大缩短转基因周期[5]。CLOUGH 等[6]率先利用蘸花法成功转化了拟南芥，其转化率为0.5%～3%。许红梅等[7]研究结果表明，在花蕾期，采用5%的蔗糖、0.05%的Silwet L-77 表面活性剂可用于多种拟南芥的遗传转化。CURTIS 等[8]在对萝卜的蘸花转化研究中发现，添加适量浓度的表面活性剂Silwet L-77 可以提高转化效率。付绍红等[9]使用蘸花法成功的对油菜进行了转化，转化率可以达到0.69%。同时还发现，影响转化效率的因素还包括蔗糖浓度以及菌株的种类等，当蔗糖浓度为10%且选用GV3101 菌株时，转化效率最高。目前，该方法逐渐趋于成熟，已经在拟南芥、大豆[10]、亚麻[11]、黄瓜[12]、油菜[13]、菜心[14]、大白菜[15]、甘蓝[16]、紫花苜蓿[17]等作物中转化成功。但是对于普通白菜蘸花转化的研究报道仍然鲜见。

本试验通过对普通白菜蘸花转化中蘸花时长、次数、蘸花间隔时间、蘸花后是否喷水等影响普通白菜蘸花转化效率的多种因素的探究，得出一套普通白菜蘸花转化的最优体系，为普通白菜采用蘸花法进行遗传转化建立一定基础，使得大量获得普通白菜转基因植株更加便捷。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 供试普通白菜品种为冬性弱的75#品系，由山西省农业科学院蔬菜研究所惠赠。选取颗粒饱满、大小均匀的普通白菜种子浸种催芽，2 d 后将其置于4 ℃冰箱低温春化处理20 d。然后移栽至装有基质（珍珠岩、松针土、熟土及泥炭的混合物）的营养钵中，待其现蕾抽薹后选取有少数花朵开放的蕾期植株作为供试材料。

1.1.2 农杆菌菌株和质粒 供试根癌农杆菌菌株为GV3101，该菌株含有携带有选择标记Bar 基因和GUS 报告基因的载体。其中，整合了Bar 基因的植物将抗除草剂Basta。

1.2 试验方法

1.2.1 菌液制备 用接种环蘸取菌液在加入庆大霉素（Gen，100 mg/L）和卡那霉素（Kan，50 mg/L）的LB 固体培养基上划线培养，2 d 后挑出单个菌落转移至 10 mL 液体 LB 培养基中，28 ℃，200 r/min 振荡培养24 h 后，取75 μL 浑浊的菌液加入150 mL液体 LB 中，28 ℃，200 r/min 振荡培养 24 h。调整菌液浓度至OD600＝0.8，离心15 min 收集菌体，重悬于 250 mL 含有 1/2 MS＋0.07%MES＋5%蔗糖＋0.05%Silwet L-77[18]的侵染液中备用。

1.2.2 蘸花 对处于花蕾期的普通白菜进行蘸花侵染，同时为确立高效的转化系统，对普通白菜蘸花过程的影响因素：蘸花次数（相隔3 d 蘸2 次、相隔7 d 蘸2 次以及每相隔3 d 蘸3 次）、蘸花时间（1，2.5 min）和是否喷水（蘸花后隔日喷水和不喷水），共设计10 个处理，并将用蒸馏水蘸花处理的植株作为对照。蘸花处理之后，对其进行人工辅助授粉，并进行套袋隔离，待种子完全成熟之后进行采种。

1.2.3 Basta 抗性株筛选 将待筛选T1种子播于苗盘中，待子叶长出后，每3 d 喷施1 次0.002%的Basta 溶液，并及时去除黄化萎蔫的幼苗，喷施7～10 次后，筛选出仍能健康生长的植株，得到具有除草剂Basta 抗性的植株。

1.2.4 GUS 活性检测 取普通白菜的真叶作为对照，对经过抗病筛选的植株叶片参照YONG 等[19]的方法进行GUS 染色检测。

1.2.5 PCR 检测 利用CATB 法提取筛选植株的DNA，采用体外扩增的方式对目的基因Bar 基因进行检测，反应程序为：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1 min，共设置39 个循环。

2 结果与分析

2.1 蘸花结籽情况分析

对经过蘸花处理后的普通白菜进行结籽情况统计，结果列于表1。在蘸花时长方面，同等蘸花次数与蘸花间隔时长下，蘸花时间为1 min 时，所收获的种子的数量与干质量都要优于蘸花时间为2.5 min时收获的种子；在蘸花次数方面，同等条件下，共蘸2 次所收获的种子干质量和数量都要优于共蘸3 次，此外进行3 次蘸花的植株甚至出现了部分花序萎蔫、坏死等情况，严重影响结籽量；在蘸花间隔时间方面，同等条件下，蘸花间隔时间为7 d 时，收获的种子的干质量和数量都要优于蘸花间隔为3 d 时；在是否喷水方面，在蘸花次日不对花序进行喷水处理的植株出现了花序脱水、萎蔫、干瘪等症状，喷水则可以有效的稀释侵染液的浓度，并缓解相应的脱水症状，导致结籽数和干质量都要优于未经喷水处理的植株。因此，采用蘸花时间1 min，每隔3 d 蘸花1 次共蘸花2 次的组合与蘸花时间2.5 min，每隔7 d 蘸花1 次共蘸花2 次的组合，植株的结种情况较优。整体而言，较长的蘸花间隔时间（7 d）或者较短的蘸花持续时长（1 min）以及蘸花后第2 天对植株喷水处理会使结籽的数量和质量更优。

表1 各处理普通白菜蘸花结籽情况

2.2 T1抗性植株的筛选

成功转化的植株将具有Basta 抗性，因此，用含有0.002%的Basta 溶液对T1幼苗进行筛选，结果发现，在T1幼苗中，只有第1 次试验中采用蘸花2.5 min，7 d 后再次蘸花，且蘸花次日不喷水的组合获得1 株具有Basta 抗性的幼苗。其他组合均未获得。

2.3 T1抗性植株GUS染色试验

成功转化的植株因为携带有GUS 报告基因，所以，能被 GUS 染液染色[20]，取具有Basta 抗性的T1幼苗真叶进行GUS 染色试验，结果如图1所示。由图1可知，只有4 号幼苗的真叶能够被GUS 染色，其他幼苗均表现和对照组一致。表明4 号幼苗被成功转化。

2.4 T1抗性植株的PCR鉴定

分别提取对照组和抗性植株DNA，体外扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，4 号植株与阳性对照在同一位置都有明显条带，大小约为370 bp，与Bar 基因的372 bp 一致，而其他植株没有相应的条带，这说明目的基因已经成功整合到普通白菜植株中。

2.5 T2植株GUS染色试验

将确定已经成功整合目的基因的4 号幼苗移入土壤中栽培，待其抽薹结籽后收获T2种子。随机选取30 粒种子经春化处理后播种，待幼苗长出5～6 片真叶时，取幼苗真叶进行GUS 染色试验，结果如图3所示。由图3可知，T2的幼苗1～7 号叶片均能被GUS 染液染色，而对照组无法被染色，表明T2得到的植株是纯合的，而且其除草剂抗性得到了稳定遗传。

2.6 T2植株幼苗的PCR鉴定

分别提取30 株T2植株DNA，体外扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。从图4可以看出，在待测的8 个样本中，有7 个样本与阳性对照在同一位置都有明显条带，大小约为370 bp，与Bar 基因的372 bp 一致，而阴性对照在370 bp 处无明显条带，说明Bar 基因已经成功的整合并高效的遗传给了下一代，但不排除由于多拷贝导致的T2植株PCR 扩增后呈阳性的比例较高，还有待于Southern 杂交验证。

3 讨论

不同的蘸花时间、次数以及间隔时长对不同植物遗传转化的效果不同[21]。在早期农杆菌真空渗透转化拟南芥的方法中，CHUNG 等[22]研究发现，蘸花时间由5 s 变为5 min，其转化效率大大提高，但蘸花时间过长会影响花序成活率。YANG 等[15]在大白菜中蘸花3 min，获得转基因植株。而本研究表明，较短的蘸花时间和较长的间隔时长虽然可以减轻侵染液对花蕾的负面作用，增加结籽量，但是无法获得成功转化的植株，只有当蘸花时间为2.5 min时，虽然结籽量有一定影响，却可以得到有效转化的植株，在农杆菌介导的遗传转化体系中对转化率尤为重要，尤其是无限生长型花序的植株[23]。CLOUGH 等[7]研究发现，每隔5 d 对拟南芥进行一次蘸花处理，连续处理3 次，可以有效提高转化效率，而大白菜每隔5～7 d 蘸花一次共蘸2 次，其转化效率仅为0.1%，这可能是由于农杆菌很难通过蘸花处理进入白菜花器官[24]。本研究结果表明，只进行1 次蘸花处理，结籽的数量与质量要明显优于2 次或多次蘸花处理，蘸花时间较短时，结籽的效果也更优。而蘸花2.5 min 并且蘸花2 次虽然植物结籽数受到较大影响，但只有这一种组合能获得稳定遗传的转基因后代，因此，在使用蘸花法进行普通白菜遗传转化时，推荐使用这一组合的处理。

关于蘸花次日是否进行喷水处理影响结籽率与转化成功率的方面，本研究认为因为侵染液中所含有的5%蔗糖会经由花序进入被植物吸收，高浓度的蔗糖溶液会影响植物细胞渗透压，使得植物出现脱水、萎蔫等症状，大大影响结籽率，而且喷水可以稀释蔗糖浓度，减少高浓度蔗糖对植物渗透压的影响，此外喷水还可以稀释农杆菌的浓度，减少农杆菌对植物的毒害作用，虽然可以提高结籽率，但是会使转化效率大大降低，因此，在使用蘸花法进行普通白菜遗传转化时，不推荐进行喷水处理。

4 结论

本试验通过对普通白菜蘸花法遗传转化的条件进行探索，最终得出了在使用蘸花法对普通白菜进行遗传转化时，使用蘸花2 次、每次间隔7 d、每次蘸花2.5 min 且蘸花后不喷水处理的组合，能够获得具有广谱除草剂抗性且能稳定遗传的转基因普通白菜。本试验将为普通白菜蘸花法遗传转化提供一定指导。