右美托咪定中枢远端干预对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

陈海明,杨 玲,薛凯凯

(山西医科大学麻醉学系附属第一医院麻醉教研室,太原 030001;*通讯作者,E-mail:13623672056@163.com)

脊髓作为心脏感觉、交感神经纤维传入传出的初级中枢,近年来在心肌缺血再灌注损伤发生发展过程中的调节作用受到重视。心肌缺血会引起相应节段脊髓神经元兴奋,进而通过交感反射加重心肌细胞损伤。中枢远端干预可抑制脊髓神经元兴奋性,避免心脏交感神经过度激活,从而减轻心肌缺血再灌注损伤[1]。目前,文献报道,鞘内吗啡后处理可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,其机制可能与提高迷走神经兴奋性,释放乙酰胆碱,激活M受体通路有关[2]。但吗啡属于阿片类药物,有剂量依赖性,常见的有恶心、呕吐、皮肤瘙痒、尿潴留水肿,严重时会出现呼吸抑制、痛觉过敏,而且长期应用会出现耐药[3]。右美托咪定是一种新型、安全、强效、高选择性的α2肾上腺素能受体激动剂,具有抗炎及器官保护作用。有研究显示,右美托咪定通过静脉输注可减轻氧化应激反应,抑制炎性细胞因子的释放,对MIRI有保护作用[4]。而其是否可以通过中枢途径作用而起到心肌保护作用尚未见报道。本实验旨在探讨右美托咪定中枢远端干预对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂

SPF级雄性Wistar大鼠,6-8周龄,体质量200-250 g,由山西医科大学实验动物中心提供(2016.10)。右美托咪定注射液(批号:170403BP,江苏恒瑞医药股份有限公司),兔抗鼠c-fos抗体(稀释度1 ∶800,CST)、HRP山羊抗兔IGg(H+L)(稀释度1 ∶200,北京中杉金桥生物技术有限公司),cTnI检测试剂盒(天津德普诊断产品公司),Elecsgs2010化学发光免疫分析仪(Roche公司,德国)。

1.2 蛛网膜下隙置管

腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠,参照文献[5]的方法鞘内置管:取俯卧位,在颈背部沿脊柱切开皮肤3 cm,分离肌肉组织,经椎间隙用18号针头轻轻刺破硬脊膜至蛛网膜下隙,可见脑脊液流出,将PE-10导管置入蛛网膜下隙8 cm,固定导管,缝合伤口。术后肌肉注射青霉素40万IU,鞘内注射2%利多卡因10 μl[6],15 s后大鼠出现后肢瘫软且在30 min后恢复,提示鞘内置管成功。利多卡因试验阴性或出现单侧肢体瘫痪的大鼠弃用,分笼单独饲养3 d。

1.3 心肌缺血再灌注损伤模型

经腹腔注射1.5%戊巴比妥钠溶液0.005 ml/g,麻醉后记录标准Ⅱ导联心电图,行气管切开置管连接微型动物呼吸机行机械通气,呼吸频率为80-90次/min,潮气量2 ml/100 g,吸呼比1 ∶2,同时记录心率及血压变化情况。沿胸骨左缘开胸,暴露心脏,剪开心包,在左心耳下缘与肺动脉圆锥间可见冠状动脉左前降支起始部,于此处穿线结扎,心电图可见ST段弓背向上抬高,提示结扎成功。缺血30 min后剪开结扎线,恢复血流使冠状动脉再灌注,可见左心室前壁转为红色,心电图可见抬高的ST段下降超过50%,提示再灌注成功,将所选大鼠按随机数字表法分为假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)和鞘内右美托咪定预处理组(DEX组)。假手术组只穿线不结扎,其余两组均采用冠状动脉左前降支结扎30 min后立即恢复再灌注120 min方法建立MIRI模型。右美托咪定组大鼠在缺血前30 min经鞘内注射右美托咪定1 μg/kg(用生理盐水稀释至10 μl),其余两组于缺血前30 min经鞘内注射生理盐水10 μl。

1.4 血清肌钙蛋白I(cTnI)浓度的测定

于再灌注120 min时,从腹主动脉采集血样2 ml,4 ℃下3 000 r/min,离心20 min,离心半径8 cm,取上清液收集至EP管,检测血清cTnI浓度。该方法是将血清中的待测分子和辣根过氧化物(HRP)标记的固相载体上的抗体特异性结合后加入鲁米诺Luminol发光底液,由仪器读出各孔的光子数,利用标准曲线算得血清肌钙蛋白I的浓度。

1.5 血浆去甲肾上腺素(NE)浓度的测定

再灌注120 min时,从腹主动脉采集血样2 ml,4 ℃下3 000 r/min,离心20 min,离心半径8 cm,取上清液收集至EP管。检测前取出试剂盒内试剂室温下平衡30 min,每孔加入100 μl标准品或样品,贴上封板膜,37 ℃孵育2 h后吸出每个孔的液体,每孔加入100 μl生物素-抗体工作液,37 ℃孵育1 h,之后吸出每个孔并用洗涤液(200 μl)填充每个孔静置2 min,弃去液体,通过在纸巾上拍打板来移除剩余的液滴,重复该过程3次;每孔加入100 μl HRP-抗生物素蛋白工作液,用新的封板膜覆盖微板,37 ℃孵育1 h,重复洗涤3次后每孔加入90 μl TMB底物,37 ℃孵育10-30 min。当含有最高浓度标准品的前四个孔显现出明显的蓝色时,向每个孔中加入50 μl终止液,于450 nm处测吸光值,做标准曲线,计算出血浆去甲肾上腺素的浓度。

1.6 心肌梗死面积测定

再灌注120 min时,再次结扎左冠状动脉前降支,经股静脉缓慢注入1%伊文思蓝溶液1 ml,待大鼠舌唇和近端皮肤蓝染后,取出大鼠心脏,用预冷PBS溶液漂洗数次后将心脏放入-20 ℃冰箱冷冻1.5 h,沿心脏纵轴从心尖开始将其均匀切成厚度为2 mm薄片(5-6片),置于1% TTC溶液中(2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液),37 ℃水浴箱(pH值7.4)中避光染色15 min,将心肌切片浸于4%多聚甲醛溶液中固定10 min,心肌薄片染成蓝色区域是正常组织,染成白色区域为坏死组织,染成红色区域为缺血未梗死心肌组织。拍照后经B1-2000图像分析软件计算相关区域面积。计算梗死区域与危险区域的面积百分比表示心肌梗死程度。

1.7 c-fos表达的测定

再灌注120 min时,取脊髓L3,4节段置于4 ℃ 4%多聚甲醛溶液中固定4 h,再移入4 ℃ 20%蔗糖溶液中至组织沉底,冰冻切片机冠状连续切片厚5 μm,用二步法进行免疫组织化学反应;加入一抗工作液(Fos抗体,兔抗鼠1 ∶800),4 ℃过夜,再滴加二抗工作液(羊抗兔),37 ℃孵育30 min。以上各步骤间以0.01 mol/L PBS液漂洗3次切片,最后以二氨基联苯胺(DAB)显色系统显色,控制显色时间,出现棕黄色颗粒时终止反应,苏木素轻度复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,封片。阴性对照以PBS液替代一抗,余步骤相同。用BX-51型显微镜及BIS-2000数码显微图像分析系统进行图像分析,每只大鼠于L3,4节段取2张切片,采集每张涂片5个相互不重合视野(×400),Fos样免疫反应阳性细胞呈圆形或者卵圆形,细胞核呈棕黄色,胞质、核仁均不染色,计数每个标本的fos免疫反应阳性细胞数目。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 血流动力学指标的比较

三组大鼠术前平均动脉压(MAP)与心率水平比较差异无统计学意义(P>0.05);除假手术组外,其他两组大鼠在缺血30 min与再灌注120 min时MAP与心率低于术前(P<0.05);与假手术组比较,缺血再灌注组与右美托咪定组在缺血30 min与再灌注120 min时MAP和心率低(P<0.05);与缺血再灌注组比较,右美托咪定处理组在缺血30 min时MAP和心率降低,再灌注120 min时升高(P<0.05,见表1)。

表1 大鼠血流动力学指标的比较(n=15)

Table 1 Comparison of hemodynamic parameters in rats among three groups(n=15)

组别平均动脉压(MAP,mmHg)心率(HR,次/min)基线缺血30 min再灌注120 min基线缺血30 min再灌注120 min S组105.36±6.2899.60±5.98103.2±6.42432.28±16.05428.32±18.21420.40±17.98I/R组104.76±5.9872.21±6.74#63.79±8.01#435.42±13.38381.7±16.89#320.5±23.54#DEX组106.23±6.0375.32±6.15#72.1±7.22#∗433.61±14.26376.9±27.36#365.7±28.35#∗

与基线相比,#P<0.05;与I/R组相比,*P<0.05

2.2 心肌梗死面积比较

I/R组和DEX组心肌梗死面积分别为(53.2±1.9)%和(32.3±2.8)%;DEX组心肌梗死面积较I/R组降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3 生化指标及c-fos表达水平的比较

与S组比较,I/R组与DEX组血清cTnI和NE浓度升高,脊髓背角c-fos表达上调(P<0.05);与I/R组比较,DEX心肌梗死面积、血清cTnI和NE浓度降低,脊髓背角c-fos表达下调(P<0.05,见表2)。

表2 大鼠血浆cTnI、NE浓度及脊髓背角c-fos阳性细胞计数的比较

Table 2 Comparison of plasma cTnI, NE concentration and c-fos positive cell count in rat spinal cord among three groups

组别肌钙蛋白I(cTnI,ng/μl)血浆去甲肾上腺素(NE,pg/ml)c-fos表达水平S组0.28±0.03204±182.26±0.19I/R组1.86±0.21#498±12#76.32±5.16#DEX组0.69±0.05#∗310±10#∗45.42±3.03#∗

与S组相比,#P<0.05;与I/R组相比,*P<0.05

3 讨论

由以上实验结果可见,DEX组与I/R组比较,心肌梗死面积、血清cTnI浓度及去甲肾上腺素水平均出现了显著性降低,提示右美托咪定中枢预处理可减轻大鼠心肌缺血再灌注的损伤。

心肌缺血再灌注损伤机制尚未完全阐明,目前主要有氧自由基爆发、Ca2+超载、心肌能量代谢障碍、内皮细胞功能障碍、中性粒细胞浸润、线粒体损伤、自噬与凋亡以及缺血导致的儿茶酚胺大量释放等有关[7]。有研究发现缺血后心肌膜上的α和β受体密度都会增加,此时内源性儿茶酚胺会刺激α和β受体,通过相关途径异化了Ca2+内流,使细胞内Ca2+的浓度增加,导致心肌缺血再灌注损伤的发生[8]。

右美托咪定作为一种新型高效的α2受体激动剂,目前被广泛应用于临床。有研究显示,右美托咪定可能通过作用于脊髓突触前膜和突触后膜的α2受体,增强下行抑制通路对背角经元的作用,通过突触前抑制减少神经介质释放,抑制交感中枢的活性间接增加迷走神经活动[9],从而在脊髓水平减少儿茶酚胺的合成与释放,使得血浆儿茶酚胺浓度降低,延长冠脉在舒张期的灌注时间,降低前后负荷,减少心脏氧耗,抗心律失常,减少心肌梗死面积[10]。有研究表明,椎管内注射右美托咪定会造成神经损伤。大鼠蛛网膜下隙注射右美托咪定2-3 μg/kg后小突胶质细胞有脱髓鞘改变,而注射1 μg/kg偶有髓鞘肿,仅表现为包绕轴突的髓鞘空泡和分层样变,低剂量药物对脊髓的损伤作用最轻[11]。因此本实验研究中选用了右美托咪定1 μg/kg进行鞘内注射,以减轻药物注射本身对神经系统的不利影响。

既往文献报道[12,13],原癌基因c-fos与心血管疾病密切相关,c-fos是细胞受到外界刺激最先表达的基因,其编码的c-fos蛋白与c-Jun蛋白结合成激活蛋白转录因子1(activator protein transcription factor-1,AP-1),才能激活靶基因的转录表达。发生心肌缺血时,c-fos能即刻快速表达,MAPK家族成员ERK1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2)是将胞外刺激信号传递到胞内的共同通路,ERK1/2自我磷酸化后可通过磷酸化Elk-1(Ets-like protein-1),进而诱导c-fos的转录。在正常生理情况下,c-fos基因及蛋白仅有少量表达,当机体受到缺血缺氧等刺激时,c-fos蛋白显著增加。c-fos蛋白能够在脊髓的后角产生一定的表达作用[14]。本实验结果中,右美托咪定鞘内注射后,脊髓背角c-fos的表达下调,提示右美托咪定鞘内注射,能够减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。

综上所述,右美托咪定中枢预处理可减轻大鼠心肌缺血再灌注的损伤,其机制可能与降低血浆NE水平,抑制脊髓背角c-fos表达有关,但其下游水平基因表达的改变尚不明确,右美托咪定在中枢作用的机制有待进一步研究。