长白山东坡不同海拔落叶松土壤微生物碳代谢及酶活性研究

段益莉，李继侠，江强，赵鸿宇

1. 内江职业技术学院，四川 内江 641100；2. 郑州科技学院，河南 郑州 450064；3. 北京林业大学园林学院，北京 100083

土壤酶是催化土壤有机物质分解的蛋白质，主要来源于微生物、植物根系及动物的分泌释放（Xu et al.，2017；Kaurin et al.，2018）；它参与土壤中有机物质转化的全过程，直接或间接影响着土壤一系列的生物化学反应，对生态系统的物质循环产生重要影响（Wu et al.，2017；Esch et al.，2017）。土壤呼吸作为土壤碳通量和陆地生态系统碳循环的关键成分，土壤呼吸的微小变化将对大气碳热平衡产生巨大影响（Li et al.，2017；Bond-Lamberty et al.，2018）。土壤呼吸速率很小的变化都将使大气CO2浓度和土壤碳吸存发生巨大的改变，在全球尺度，森林土壤呼吸释放的CO2量为77 Pg·a-1（以C计，下同），仅次于全球总初级生产力（100－120 Pg·a-1），大于全球陆地生态系统的净初级生产力（50－60 Pg·a-1）（Mayer et al.，2017；Bréchet et al.，2017），准确评估土壤呼吸作用及其对全球变化的响应具有十分重要的意义。土壤微生物参与土壤有机质分解、腐殖质形成、土壤养分转化和循环等过程，是土壤生物化学特征的重要组成部分，在评价土壤肥力、环境监测、土地利用等方面有广泛的作用（Bore et al.，2017；Müller et al.，2017）。受技术和方法的限制，以往的研究多侧重于对微生物数量等研究，而表现土壤微生物在组成和区系上的变化，还要结合土壤微生物多样性的研究。近年来，生物化学及分子生物学等测试技术的进步，推动了土壤微生物多样性的研究（Hernández et al.，2017；Zhang et al.，2017）。对土壤微生物多样性的研究主要从物种、功能和遗传多样性3个层面展开的，其中碳素利用法、磷脂脂肪酸（PLFA）分析法和核酸分析法是研究微生物多样性普遍采用的 3种技术。其中，碳素利用法通常采用Biolog微平板法，其理论依据是Biolog-Eco微平板代谢多样性类型的变化与群落组成（Joergensen et al.，2018）。Biolog-Eco微平板是对功能微生物群落变化较为敏感的指标，被广泛应用于评价土壤微生物群落的功能多样性，也可以用于估价土壤微生物群落代谢多样性和功能多样性的研究。

长白山地处中国北方中纬度，属典型的温带大陆性季风气候区，是中国气候变化比较剧烈的地区（牟长城，2003；张先亮等，2010）。该地区生境条件丰富多样，具有完整的森林生态系统。该区历史上曾有多次火山喷发，火山喷发释放的大量火山碎屑物在强劲偏西风的作用下主要沉积在长白山东坡，导致该区域植被数次被毁灭。与北坡具有的完整的植被带相比，东坡植被无明显的垂直分异，从山脚到山顶处均为长白落叶松（Larix olgensis）纯林（吕林昭等，2008）。由于东坡长白落叶松海拔分布范围广，长白落叶松又是该地区森林演替的一个过渡树种，因此，对不同海拔高度的长白落叶松和气候之间关系的研究，对预测未来气候变化情景下长白落叶松的演替趋势具有指导作用。鉴于此，基于2013－2017年连续5年对长白山东坡不同海拔落叶松土壤微生物碳代谢及酶活性调查分析数据，利用Biolog-Eco微平板法研究土壤微生物碳代谢及酶活性，旨在进一步加强对土壤微生物碳代谢特征的了解，为揭示森林生态系统土壤微生物碳代谢特征和酶活性的监测提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

长白山（41.52°－2.47°N；127.15°－128.92°E）位于中国吉林省东南部中朝交界处，为中国乃至全球自然生态系统保存最为完整的一个地区。该区气候特征为受季风影响的温带大陆性季风气候，春季多大风，夏季温暖多雨，秋季凉爽多雾，冬季寒冷漫长，温度与降水四季变化明显。长白山地区雨热同期，降水导致的干湿季节差异明显。年平均气温-7.04 ℃，1月份最冷（-22.89 ℃），7月份最热（8.67 ℃），年降水量为1361 mm，降水主要集中在6－8月，约占全年降水量的 62%以上。长白山北坡具有明显的植被垂直更替。随海拔升高，植被依次为阔叶林带（海拔＜500 m）、阔叶红松林带（海拔500－1100 m）、云冷杉林带（海拔1100－1700 m）、山地岳桦林带（海拔1700－2000 m）和位于火山锥体上部的高山苔原带（海拔＞2000 m）。这种完整的垂直带谱仅在北坡比较典型，其他坡向不明显或无垂直分异，尤其是东坡，从山底到山上均为长白落叶松林，其年平均气温和降雨量如图1所示。

1.2 试验设计

图1 研究区近5年平均气温和降水量月值变化Fig. 1 Mean temperature and precipitation in recent 5 years in study site

分别在长白山东坡3个海拔设立样地进行调查采样，群落均为未受人为干扰的原始林，其中高海拔（1990 m）、中海拔（1652 m）和低海拔（1447 m）样地各3个，分别于2013年8月－2017年8月调查取样。高海拔落叶松由于常年受山顶强风的影响，呈典型的旗形树冠，为长白落叶松纯林，郁闭度约为0.91。中海拔和低海拔采样点郁闭度分别为0.92和0.94。于2012年8月建立固定样地，面积为1 hm2，林木优势年龄170 a，平均胸径29.0 cm，平均树高24.0 m，苔藓层发达。

1.3 土壤呼吸和酶活性测定方法

在研究区布设监测点并标记，在第一次测定土壤呼吸（MR）之前，提前一天将测定基座嵌入土壤中，将每个基座内存留的地表植被自土壤表层彻底剪除，聚氯乙烯圆柱体经过24 h平衡后，土壤呼吸速率可恢复至基座放置前的水平，从而避免了因安置气室对土壤产生扰动而造成的短期内呼吸速率波动。采用动态密闭气室红外CO2分析仪（IRGA）法，测定仪为美国Li-6400便携式气体分析系统和Li-6400土壤呼吸室，土壤呼吸日变化测定为白天每隔2 h测定1次，在06:00－18:00点之间测量，每个监测点1次测定2个平行取平均值。在观测土壤呼吸的同时，使用手持长杆电子温度探针测定 0－10 cm深处的土壤温度，同时使用TDR测定每个监测点附近0－10 cm范围内的土壤湿度。采集不同海拔监测点0－10 cm混合土样两份，带回实验室，一份自然风干（15－20 d），去除碎片和部分根后过 0.5 mm筛，测定土壤微生物量碳含量（MBC）；另一份保存于4 ℃冰箱中，用于测定土壤酶活性和微生物多样性。

土壤微生物呼吸即土壤基础呼吸的测定采用碱液吸收法；土壤微生物代谢熵（qCO2）为土壤微生物呼吸与土壤微生物生物量碳（MBC）的比值，计算公式为：qCO2=MR/MBC（Mayer et al.，2017；Bréchet et al.，2017）。

土壤水解酶活性的测定均采用对硝基苯酚（pNP）法。分别以对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷、对硝基苯酚乙酰基氨基葡萄糖苷、L-亮氨酸-4-硝基苯胺和对硝基苯磷酸二钠为底物测定糖苷酶、几丁质酶、亮氨酸氨基肽酶以及磷酸酶的活性（Xu et al.，2017；Kaurin et al.，2018）。

土壤微生物群落功能多样性可以用Shannon多样性指数（H）、McIntosh指数（E）和 Simpson指数（Ds）来表征，在计算Simpson指数时，将数据扩大1000倍。采用Biolog-Eco微平板温育150 h的数据进行多样性分析。Biolog-Eco微平板中单一碳源的反应程度，即土壤微生物对单一碳源的利用能力，采用平均每孔颜色变化率（Average well color development，AWCD）来描述。AWCD值较大表示土壤微生物具有较高的碳源利用能力和微生物丰度，AWCD的计算公式为（Bore et al.，2017；Müller et al.，2017）：

式中，Ci为第i孔的吸光值；R为对照孔的吸光值。对于(Ci-R)＜0 的孔，将其记为 0，即(Ci-R)≥0。

式中，Pi为第i孔的相对吸光值与整个微平板的相对吸光值总和的比值，计算公式：

N为被利用碳源的总数，吸光值≥0.25所有微孔的总和。

运用Excel 2003整理数据，SPSS 13.00对数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），采用LSD法进行差异显著性检验。采用CANOCO 5.0中的排序分析法分析土壤酶活性与微生物多样性之间的关系。

2 结果与分析

2.1 不同海拔落叶松土壤微生物群落代谢平均颜色变化率

微生物群落功能多样性能够反映土壤中微生物的生态功能，采用Biolog-Eco微平板加入的碳源一般是植物根系分泌物，更能代表根际土壤微生物群落可利用的碳源，与土壤微生物群落的生态功能更具相关性。平均颜色变化率（AWCD）是判断土壤微生物群落利用碳源能力的重要指标之一，代表土壤微生物的代谢活性。不同海拔落叶松土壤开始培养后每隔24 h测定AWCD值，得到AWCD随时间的动态变化图（图 2），由图可知，随着培养时间的延长，不同海拔落叶松土壤微生物碳源利用总体上呈逐渐增加的趋势，培养初期25 h内AWCD变化不明显，不同海拔落叶松土壤微生物碳源利用在培养25－75 h内AWCD快速增长，此时微生物活性旺盛，75 h后增长缓慢，150 h后急剧增长；在培养50 h以前，不同海拔落叶松土壤微生物碳源利用基本相一致，在50 h以后，相同时间土壤微生物碳源利用大致表现为低海拔＞中海拔＞高海拔，局部有所波动。

图2 不同海拔落叶松土壤微生物群落代谢平均颜色变化率Fig. 2 Average metabolic color change rate of soil microbial community along an altitudinal gradient

2.2 不同海拔落叶松土壤微生物对碳源利用强度

土壤微生物多样性反映了群落总体的变化，但未能反映微生物群落代谢的详细信息。根据不同海拔落叶松土壤微生物碳源利用情况（表 1），综合考虑其变化趋势，选取光密度增加较快的150 h的AWCD值进行土壤微生物群落代谢多样性分析，按化学基团的性质将ECO板上的碳源分成6类：氨基酸类、碳水化合物类、羧酸类、聚合物、胺类、酚酸类，6类碳源均呈现出随培养时间的延长，微生物利用碳源的量逐渐增加的趋势。由表可知，土壤微生物对不同种类碳源的利用强度存在较大差异。不同海拔落叶松土壤微生物对6种不同碳源的利用率表现大致相同，5年内平均值基本表现为低海拔＞中海拔＞高海拔，不同海拔氨基酸类、碳水化合物类、羧酸类、胺类和酚酸类差异均显著（P＜0.05），低海拔和中海拔聚合物类差异不显著（P＞0.05），二者显著高于高海拔（P＜0.05）。总体而言，2013－2017年，不同海拔氨基酸类、碳水化合物类、羧酸类、聚合物、胺类、酚酸类均呈增加趋势，且碳水化合物和羧酸类碳源是不同海拔落叶松土壤微生物的主要碳源，其次为氨基酸类、酚酸类和聚合物类，胺类碳源的利用率最小。

表1 不同海拔落叶松土壤微生物对碳源利用强度Table 1 Soil microbial utilization intensity of carbon source along an altitudinal gradient

2.3 不同海拔落叶松土壤微生物群落多样性

微生物群落多样性指数可用来指示土壤微生物群落利用碳源的程度，根据培养第 150小时的AWCD值计算土壤微生物群落的物种丰富度指数（H）、均匀度指数（E）、优势度指数（Ds）和碳源利用丰富度指数（S）。结果表明（表2），不同海拔落叶松土壤微生物群落各多样性指数从 2013－2017年基本呈增加趋势；5年内物种丰富度指数（H）、均匀度指数（E）和碳源利用丰富度指数（S）平均值基本表现为低海拔＞中海拔＞高海拔，并且不同海拔差异均显著（P＜0.05）；5年内优势度指数（Ds）表现为低海拔=中海拔＞高海拔，不同海拔优势度指数（Ds）差异不显著（P＞0.05）。

表2 不同海拔落叶松土壤微生物群落多样性Table 2 Soil microbial community diversity along an altitudinal gradient

2.4 不同海拔落叶松土壤呼吸及微生物代谢熵

表3为不同海拔落叶松土壤呼吸及微生物代谢熵，由表可知，2013－2017年不同海拔落叶松土壤微生量碳、微生物呼吸和微生物代谢熵均呈增加趋势；5年内土壤微生量碳、微生物呼吸和微生物代谢熵平均值基本表现为低海拔＞中海拔＞高海拔，并且不同海拔差异均显著（P＜0.05）。

2.5 不同海拔落叶松土壤酶活性

表4表明不同海拔落叶松土壤酶活性有一定的差异，2013－2017年，不同海拔落叶松土壤糖苷酶、几丁质酶、亮氨酸氨基肽酶、碱性磷酸酶、酚氧化酶δ和过氧化物酶δ均呈增加趋势；5年内土壤糖苷酶、几丁质酶、亮氨酸氨基肽酶、碱性磷酸酶、酚氧化酶δ和过氧化物酶δ平均值基本表现为低海拔＞中海拔＞高海拔，其中几丁质酶、亮氨酸氨基肽酶、酚氧化酶δ和过氧化物酶δ在不同海拔差异均显著（P＜0.05）；中海拔和高海拔糖苷酶差异不显著（P＞0.05），二者显著低于低海拔（P＜0.05）；同样中海拔和高海拔碱性磷酸酶差异不显著（P＞0.05），二者显著低于低海拔（P＜0.05）。

表3 不同海拔落叶松土壤呼吸及微生物代谢熵Table 3 Soil microbial metabolic entropy along an altitudinal gradient

表4 不同海拔落叶松土壤酶活性Table 4 Soil enzyme activity along an altitudinal gradient

2.6 土壤酶活性与微生物群落多样性之间相关性

土壤酶活性为土壤微生物的重要碳源和氮源，为探讨土壤酶活性与土壤微生物群落多样性之间的关系，进行了土壤酶活性与微生物群落多样性相关性分析（表5和图3）。由表5可知，糖苷酶与物种丰富度指数、土壤微生物量碳、土壤微生物呼吸和土壤微生物代谢熵呈极显著的负相关（P＜0.01），与碳源利用丰富度指数呈显著的负相关（P＜0.05）；几丁质酶与土壤微生物量碳、土壤微生物呼吸和土壤微生物代谢熵呈显著正相关（P＜0.05）；亮氨酸氨基肽酶与土壤微生物量碳、土壤微生物呼吸和土壤微生物代谢熵呈极显著正相关（P＜0.01），与物种丰富度指数、均匀度指数、碳源利用丰富度指数呈显著正相关（P＜0.05）；碱性磷酸酶与土壤微生物代谢熵呈极显著正相关（P＜0.01），与土壤微生物量碳、土壤微生物呼吸呈显著正相关（P＜0.05）；酚氧化酶δ与土壤微生物呼吸和土壤微生物代谢熵呈极显著正相关（P＜0.01），与物种丰富度指数呈显著正相关（P＜0.05）；过氧化物酶δ与土壤微生物呼吸和土壤微生物代谢熵呈显著正相关（P＜0.05）。

图3 土壤酶活性与微生物多样性之间PCA排序图Fig. 3 Sequence diagram in soil enzyme activity and microbial diversity

土壤酶活性与微生物多样性之间 PCA排序分析表明：土壤微生物呼吸和土壤微生物代谢熵是箭头连线最长且都与物种第1排序轴和环境第1排序轴呈极显著正相关，说明它们在第1排序轴上的位置很大程度上反映了其生态特点，是影响微生物多样性分布的主要环境因子。其中土壤几丁质酶、亮氨酸氨基肽酶对土壤微生物群落功能多样性贡献为正，这是造成不同海拔落叶松土壤微生物群落多样性差异的重要原因。

3 讨论

作为土壤微生物碳代谢特征的重要方面，微生物生物量碳与微生物呼吸对环境变化敏感，能够较早地指示生态系统功能的变化，是土壤生态系统的预警及灵敏指标（Ward et al.，2017；Xu et al.，2017；McMahon et al.，2017）。土壤微生物生物量碳是土壤有机质中活性较高的部分，是土壤活性有机碳库的重要组成部分之一。土壤微生物生物量碳周转时间很快，对环境变化十分敏感，可以在土壤碳库产生变化之前反映出土壤微小的变化（Liang et al.，2017）。土壤微生物呼吸实质是微生物对土壤有机质的分解过程，即土壤有机质潜在的矿化速率。土壤微生物呼吸反映了土壤微生物的总体活性和土壤物质代谢强度，其变化与否以及变化方向表明了系统对胁迫的敏感程度和响应模式（Arcand et al.，2017；Srivastava et al.，2017）。微生物代谢熵反映了土壤微生物群落维持能量的大小及其对土壤有机成分的利用效率。它将土壤微生物生物量碳的大小与微生物整体活性有机地结合起来，是反映环境因素对微生物活性的影响的另一个敏感性指标（Zhou et al.，2017；Kéraval et al.，2017）。土壤微生物代谢熵小，意味着微生物呼吸所消耗的碳的比例小，而用于建造微生物细胞的碳的比例相对增大，土壤微生物利用碳的效率高，对土壤质量的维持起到一定作用（Sinsabaugh et al.，2017；Bailey et al.，2018）。本研究发现，不同酶种类在不同海拔差异有别，其中低海拔华北落叶松土壤土壤糖苷酶、几丁质酶、亮氨酸氨基肽酶、碱性磷酸酶、酚氧化酶δ和过氧化物酶δ显著高于中海拔和高海拔，这表明低海拔华北落叶松有利于有机物质的水解；同时也说明低海拔华北落叶松土壤微生物对有机碳的利用率高，故土壤复杂有机碳转化的速度较高。

表5 土壤酶活性与微生物多样性之间相关性Table 5 Correlation between soil enzyme activity and microbial diversity

平均颜色变化率（AWCD）是反映土壤微生物活性，即利用单一碳源能力的一个重要指标，在一定程度上反映了土壤中微生物种群的数量和结构特征（Hernández et al.，2017；Zhang et al.，2017）。AWCD值越大，表明细菌密度越大，活性越高；反之，细菌密度越小，活性越低。分析不同海拔落叶松土壤微生物群落的代谢活性发现，不同海拔落叶松土壤微生物活性呈现一致的变化趋势，在整个培养过程中，低海拔落叶松土壤微生物对Biolog-ECO板中碳源的代谢能力明显高于中海拔和高海拔，可能的原因是：低海拔落叶松土壤中存在着与Biolog-ECO板中碳源物质高度协调的微生物（其养分含量较高），植物残体和根系分泌物数量都很多，导致进入土壤的新鲜有机物质显著增加，这大大刺激了土壤微生物的生长和繁殖，促使其代谢活性显著提高（Liang et al.，2017；Arcand et al.，2017）。因此，在微生物生长的温度范围内，随着温度升高，生长速度加快，微生物代谢活性增强。本研究中土壤微生物对不同种类碳源的利用强度存在较大差异，不同海拔落叶松土壤微生物对6种不同碳源的利用率表现大致相同，5年内平均值基本表现为低海拔＞中海拔＞高海拔，2013－2017年不同海拔氨基酸类、碳水化合物类、羧酸类、聚合物、胺类、酚酸类均呈增加趋势，并且碳水化合物和羧酸类碳源是不同海拔落叶松土壤微生物的主要碳源，其次为氨基酸类、酚酸类和聚合物类，胺类碳源的利用率最小。

本研究表明，2013－2017年不同海拔落叶松土壤微生量碳、微生物呼吸和微生物代谢熵均呈增加趋势；5年内土壤微生量碳、微生物呼吸和微生物代谢熵平均值基本表现为低海拔＞中海拔＞高海拔，并且不同海拔差异均显著（P＜0.05）；土壤酶活性和土壤微生物群落多样性也呈一致的变化规律。主要是由于随着海拔的增加，植物凋落物和有机质含量降低，会显著减少土壤微生物生物量碳、微生物呼吸，降低土壤微生物代谢熵，土壤微生物生长受到抑制，活性降低，微生物需要消耗大量能量来维持生存，对土壤养分的利用效率下降。低海拔地区土壤有机物质丰富，为土壤微生物生长提供更多碳源和可利用养分，促进土壤微生物的大量繁殖以及微生物的活动，导致土壤微生物对有机质的利用效率和矿化速率提高，在形成更多微生物生物量碳的同时释放 CO2，进而使土壤微生物代谢熵降低（Bailey et al.，2018；Guan et al.，2018）。此外，低海拔华北落叶松土壤微生物生物量碳、微生物呼吸及碳代谢效率最高，高海拔华北落叶松最低。主要原因为，（1）低海拔华北落叶松土壤凋落物含量高，土壤微生物通过产生特异性胞外酶分解外源有机质，同时也会分解土壤原有的有机质，进而引起激发效应。而外源有机质的多样性越高，土壤微生物产生的胞外酶的多样性越丰富，从而促进土壤原有有机质分解，使土壤原有有机质的微生物可利用性提高，有利于土壤中微生物的生长，进而导致低海拔华北落叶松土壤微生物生物量碳、微生物呼吸及碳代谢效率最高。（2）土壤微生物呼吸除了受到所利用底物质量的影响，还会受到温度及含水量的影响。低海拔落叶松土壤水分和温度较高，适当的水分含量有利于微生物生长繁殖，增强微生物的活性，促进土壤微生物呼吸（Kolton et al.，2017；Zhang et al.，2017；Bore et al.，2017）。

4 结论

（1）不同海拔落叶松土壤微生物群落代谢平均颜色变化率（AWCD）随培养时间延长而逐渐增加，相同时间土壤微生物碳源利用大致表现为低海拔＞中海拔＞高海拔。土壤微生物对不同种类碳源的利用强度存在较大差异，碳水化合物和羧酸类碳源是土壤微生物的主要碳源，其次为氨基酸类、酚酸类和聚合物类，胺类碳源的利用率最小。

（2）2013－2017年，不同海拔落叶松土壤微生物群落各多样性指数、土壤微生量碳、微生物呼吸、微生物代谢熵和酶活性均呈增加趋势，基本表现为低海拔＞中海拔＞高海拔。

（3）相关性分析结果表明：土壤酶活性与微生物群落多样性之间存在显著的相关关系；物种丰富度指数（H）、均匀度指数（E）和碳源利用丰富度指数（S）与土壤酶活性的相关系数绝对值均高于优势度指数（Ds），说明了土壤酶活性对土壤微生物群落优势度指数的影响作用较小。此外，土壤酶活性与微生物多样性之间 PCA排序分析表明：土壤微生物呼吸和土壤微生物代谢熵是影响微生物多样性分布的主要环境因子。其中土壤几丁质酶、亮氨酸氨基肽酶对土壤微生物群落功能多样性贡献为正，这是造成不同海拔落叶松土壤微生物群落多样性差异的重要原因。