长柄扁桃不同提取物降血脂作用有效部位的筛选

白迎春，石松利，程向晖，王登奎，高晨

（1.包头医学院 药学院，内蒙古 包头 014040；2.包头医学院 研究生学院，内蒙古 包头 014040）

高脂血症是脂质代谢或转运异常，血清中胆固醇、甘油三酯和（或）低密度脂蛋白过高和（或）血清高密度脂蛋白过低的一种病[1-2]。近年来，随着人们生活水平的不断提高，高脂血症的发病率有明显上升趋势，高脂血症发病率逐年上升，而且呈年轻化趋势，严重威胁人们的身体健康[3]。高脂血症已被证明是心脑血管疾病诸如高血压、冠心病、动脉粥样硬化、脑中风等的独立危险因素，严重危害着人们的身体健康[4]。因此积极预防和治疗高脂血症有利于降低心血管病的发病率，而控制和调节血清中总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）浓度是预防和治疗高血脂病及其并发症的关键。

长柄扁桃（Amygdalus pedunculatus Pall）是蔷薇科（Rosaceae）桃属（Amygdalus）扁桃亚属（Amygdalus）落叶灌木，又名野樱桃、柄扁桃、毛樱桃，自然分布在我国西北干旱、半干旱地区山地和沙漠地带[5-6]。长柄扁桃干燥成熟种子在中药上又称“郁李仁”[7]，有润燥滑肠、利尿等功能，并且扁桃油中含有不饱和脂肪酸及α-VE等多种药用成份，具有软化血管、促进细胞再生、提高人体免疫力和抗癌、治癌的奇特功效[8]。长柄扁桃仁中含有植物中存在的18种氨基酸，总氨基酸含量为21.19%。各种氨基酸均具有重要的生理功能，因此富含这些氨基酸的长柄扁桃仁在人体内自然也具有相应的生理功能[9]。此外，候国峰等对陕西神木、内蒙古包头、内蒙古阿拉善盟和河北承德4个不同产地长柄扁桃种仁一般成分、氨基酸、微量元素、脂肪酸及苦杏仁苷含量等进行分析，得出上述不同产地长柄扁桃种仁均富含粗脂肪（416 g/kg～478 g/kg）和粗蛋白（206 g/kg～286 g/kg） 及 Ca、Mg、P、Fe、K 等 9种对人体有益的矿质元素，未检出 Pb、Cd、Hg、As 等元素[10]。

文献报道已对长柄扁桃化学成分做了深入的研究，但对其降血脂有效部位研究较少，尚未见到对其不同部位脂代谢作用比较的研究。本课题组前期研究已证实长柄扁桃水煎液能调节高脂血症大鼠血脂水平，抵抗由高脂血症引起的脂质过氧化、保护肝脏和降低发生心血管疾病的作用[11-12]。本研究在此基础上，采用系统溶剂（石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水）分别对长柄扁桃进行提取，以高脂饲料复制高脂血症大鼠模型，测定血清TG、TC、高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、LDL-C、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）指标，观察长柄扁桃药材不同部位提取物对实验性高脂血症大鼠血脂水平的影响，确定长柄扁桃降血脂有效活性部位。

1 材料和仪器

1.1 药材及样品制备

长柄扁桃种仁采自包头市固阳，经内蒙古科技大学包头医学院石松利教授鉴定为长柄扁桃，置于室内通风处晒干。长柄扁桃药材加10 倍量体积的95%乙醇于 85℃～90℃水浴锅中回流提取 2 次，2 h/次，过滤，再将滤渣以10 倍量体积70%乙醇于85℃～90℃回流提取1 次，2 h/次，合并滤液，减压浓缩至膏状，得粗提物。粗膏和蒸馏水1∶20（体积比）溶解分散，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3 次，分散液和各萃取液的体积比为1∶1，合并各部位萃取液减压浓缩至浸膏，水部位减压浓缩至浸膏。4个部位得率分别为：石油醚部位25.42%、乙酸乙酯部位3.77%、正丁醇部位37.9%、水部位32.91%。各提取物浸膏，保存于-20℃冰箱，临用前配置成所需浓度的药液。

1.2 试剂与仪器

石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氯化钠、羧甲基纤维素钠：均为分析纯，天津市开通化学试剂有限公司；血脂康胶囊（批号：20171134）：北京北大维信生物科技有限公司；牛胆盐（批号：180208）、脱氧牛胆酸钠（批号：180128）：北京科技鸿润宝顺科技有限公司；胆固醇（批号：20180311）：河南万嘉生物科技有限公司；蛋黄粉（批号：20180318）：郑州瑞林食品添加剂有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（批号：20180704）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（批号：20180705）：南京建成生物工程研究所；ALT、AST、ALP、TC、TG、HDL-C 和 LDL-C 等试剂盒：美国贝克曼公司。

高脂饲料的配制：基础饲料77.3%、胆固醇2.0%、牛胆盐0.5%、脱氧胆酸钠0.1%、丙基硫氧嘧啶0.1%、蛋黄粉10%、猪油（猪油自制）10.0%，拌匀，加适量蒸馏水制成高脂饲料，烘干备用。

GZX-DHG 电热恒温鼓风干燥箱：山东潍坊医疗器械厂；DZW-8-8 型水浴锅：北京市永光明医疗仪器厂；RE-52A 型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；GENIUS 5K-D 全自动脱帽离心机：长沙鑫奥仪器；Olympus AU640 全自动生化分析仪：日本奥林巴斯公司。

1.3 动物

SPF 级雄性Wistar 大鼠 70只，7 周龄，由北京大学医学部（实验动物科学部）提供，许可证号为SCXK（京）2011-0012，体重（170± 30）g。

2 方法

2.1 高脂模型建立及给药干预

取Wistar 大鼠70只，采用分层随机抽样方法将大鼠分为7组，每组10只，各组平均重量相近。7组分别为正常对照组、高脂模型组、血脂康阳性药组（0.108 g/kg）、石油醚组、乙酸乙酯组、正丁醇组和水组。除正常对照组普通饲料喂养外，其余各组喂高脂饲料，自由进食及饮水。实验室温度（25±5）℃，相对湿度（50±5）%。连续5 周后眶静脉采血测血脂各项指标。从第6 周开始根据体质量（0.6 mL/100 g）进行灌胃，正常对照组、模型组给予生理盐水，各给药组分别给予1.5 g/kg（生药量）。给药期间，除正常对照组给予普通饲料外，其余各组给予高脂饲料，实验期间自由摄食饮水。每周称量体重1 次，根据体重变化调整给药容积，连续灌胃5 周。

2.2 指标测定

实验过程中，注意观察动物生长情况，如精神状态、活动、反应、胖瘦、食欲、大便等。给药5 周，末次给药后，禁食不禁水12 h，眶静脉采血，离心分离血清，同时摘取肝脏并称重。血清和脏器于-80℃保存，备用。采用测试盒测定血清 TC、TG、HDL-C、LDL-C、MDA、SOD、ALT 、AST 和 ALP 水平，同时计算肝脏系数、动脉硬化 指 数（arteriosclerosis index，AI）、HDL-C/TC 和SOD/MDA 比值。

2.3 统计分析

使用SPSS 19.0 软件对实验数据进行分析，实验结果以表示，采用单因素方差分析（one-way-AVOVA）对各组均数进行比较，以p〈0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 长柄扁桃提取物对高脂血症大鼠血清血脂水平的影响

长柄扁桃提取物对高脂血症大鼠血清血脂水平的影响结果见表1。

表1 长柄扁桃提取物对高脂血症大鼠血清血脂水平的影响（，n=10）Table 1 Effect of Amygdalus pedunculatus Pall extract on serum lipid level in hyperlipidemia rats

表1 长柄扁桃提取物对高脂血症大鼠血清血脂水平的影响（，n=10）Table 1 Effect of Amygdalus pedunculatus Pall extract on serum lipid level in hyperlipidemia rats

注：*表示与正常组比较p〈0.05，#表示与高脂模型组比较p〈0.05。

组别剂量/（g/kg）TC/（mmol/L）TG/（mmol/L）HDL-C/（mmol/L）LDL-C/（mmol/L）正常 1.44±0.26# 0.99±0.40# 0.58±0.14# 0.54±0.03#高脂模型 5.07±0.54* 3.32±0.13* 1.03±0.15* 1.87±0.06*血脂康 0.108 4.16±0.35*# 0.42±0.03*# 1.26±0.09* 1.52±0.17*#石油醚 1.50 4.60±0.42* 3.04±0.03* 1.26±0.20* 1.75±0.04*乙酸乙酯 1.50 4.98±0.32* 3.10±0.13* 1.14±0.14* 1.85±0.11*正丁醇 1.50 4.14±0.24*# 0.37±0.02*# 1.28±0.14*# 1.61±0.09*#水1.50 4.77±0.68* 3.20±0.10* 1.20±0.16* 1.70±0.25*

给药5 周后各组大鼠血清TC、TG 和LDL-C 含量显著高于正常对照组（p〈0.05），说明高脂模型稳定，造模成功。与高脂模型组比较，长柄扁桃正丁醇部位和血脂康组血清TC、TG 和LDL- C 显著降低（p〈0.05），正丁醇部位 HDL-C 含量显著升高（p〈0.05）；长柄扁桃石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位组血清TC、TG 和LDL-C 含量均有降低趋势，但均无显著性差异（p〉0.05），HDL-C 含量有升高趋势，但无显著性差异（p〉0.05）。

3.2 长柄扁桃提取物对高脂血症血清SOD和MDA含量的影响

长柄扁桃提取物对高脂血症血清SOD和MDA含量的影响结果见表2。

与高脂模型组比较，长柄扁桃石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、水部位和血脂康组的MDA 含量均降低，其中正丁醇部位和血脂康组差异有统计学意义（p〈0.05）；长柄扁桃石油醚部位、正丁醇部位和血脂康组的SOD均显著升高，有统计学意义（p〈0.05）；长柄扁桃血脂康组和正丁醇部位的SOD/MDA 值均显著升高，有统计学意义（p〈0.05）。

表2 长柄扁桃提取物对高脂血症大鼠血清SOD 和MDA 含量的影响（，n=10）Table 2 Effect of Amygdalus pedunculatus Pall extract on SOD and MDA content in serum of hyperlipidemia rats

表2 长柄扁桃提取物对高脂血症大鼠血清SOD 和MDA 含量的影响（，n=10）Table 2 Effect of Amygdalus pedunculatus Pall extract on SOD and MDA content in serum of hyperlipidemia rats

注：*表示与正常组比较p〈0.05，#表示与高脂模型组比较p〈0.05，▲表示与血脂康组比较p〈0.05。

组别剂量/（g/kg）MDA/（nmol/mL）SOD/（U/mL）SOD/MDA正常 6.94±0.92*# 302.39±44.54▲ 42.12±9.16#高脂模型 12.99±1.90*▲ 296.64±11.98▲ 23.27±3.46*▲血脂康 0.108 8.08±2.15# 336.67±20.24*# 44.05±12.82*#▲石油醚 1.50 12.82±1.59*▲ 336.42±19.94*# 25.99±4.61*▲乙酸乙酯 1.50 10.94±1.22*▲ 310.55±40.94 28.33±5.54*▲正丁醇 1.50 10.32±1.18*# 326.10±10.32# 32.17±3.68*#▲水1.50 10.46±0.22* 284.34±23.97▲ 27.07±2.75*▲

3.3 长柄扁桃提取物对高脂血症大鼠血清ALT、AST、ALP和和肝脏系数的影响

长柄扁桃提取物对高脂血症大鼠血清ALT、AST、ALP 和和肝脏系数的影响结果见表3。

表3 长柄扁桃提取物对高脂血症大鼠血清ALT、AST、ALP 和肝脏系数的影响（，n=10）Table 3 Effects of Amygdalus pedunculatus Pall extract on ALT，AST，ALP and liver coefficients in serum of hyperlipidemia rats

表3 长柄扁桃提取物对高脂血症大鼠血清ALT、AST、ALP 和肝脏系数的影响（，n=10）Table 3 Effects of Amygdalus pedunculatus Pall extract on ALT，AST，ALP and liver coefficients in serum of hyperlipidemia rats

注：*表示与正常组比较p〈0.05，#表示与高脂模型组比较p〈0.05，▲表示与血脂康组比较p〈0.05。

组别剂量/（g/kg）ALT/（U/L）AST/（U/L）ALP/（U/L）肝脏系数/（g/kg）正常 45.64±4.40# 82.73±9.36# 69.93±10.09 23.02±1.31#高脂模型 67.99±1.55*# 92.86±9.29* 148.47±6.36* 24.87±0.60*▲血脂康 0.108 55.57±7.24*# 82.25±12.53# 109.13±15.44*# 22.99±1.43#石油醚 1.50 65.33±1.65* 85.54±6.94 163.15±19.12* 24.83±1.08乙酸乙酯 1.50 64.6±4.82* 92.79±11.78 136.42±19.72*▲ 24.82±1.73正丁醇 1.50 62.07±3.49*#▲ 80.70±7.57# 117.6±6.42*# 22.82±0.43#水1.50 65.15±5.43* 82.76±12.84 108.47±13.50*# 25.00±0.92*▲

与高脂模型组比较，长柄扁桃正丁醇部位和血脂康组血清ALT、AST、ALP 和肝脏系数显著降低（p〈0.05）；长柄扁桃石油醚部位和乙酸乙酯部位组血清AST、ALT 含量和肝脏系数均有降低趋势，但无显著性差异（p〉0.05）；长柄扁桃水部位组的血清 AST 、ALT 含量均有降低趋势，但无显著性差异（p〉0.05），ALP 含量显著降低（p〈0.05）。

3.4 长柄扁桃提取物对高脂血症大鼠动脉硬化指数（AI）的影响

长柄扁桃提取物对高脂血症大鼠AI 的影响结果见表4。

与正常组相比，高脂模型组血清HDL-C/TC 比值显著降低（p〈0.05），AI 指数显著增大（p〈0.05）。与高脂模型组比较，长柄扁桃正丁醇部位和血脂康组的血清HDL-C/TC 比值显著增大（p〈0.05），AI 指数显著降低（p〈0.05）；长柄扁桃石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位组的血清HDL-C/TC 比值均有增大趋势，但无显著性差异（p〉0.05）；长柄扁桃石油醚部位和乙酸乙酯部位组AI 指数均有降低趋势，但无显著性差异（p〉0.05）。

表4 长柄扁桃提取物对高脂血症大鼠血清AI 的影响（，n=10）Table 4 Effects of Amygdalus pedunculatus Pall extract on serum AI in hyperlipidemia rat

表4 长柄扁桃提取物对高脂血症大鼠血清AI 的影响（，n=10）Table 4 Effects of Amygdalus pedunculatus Pall extract on serum AI in hyperlipidemia rat

注：*表示与正常组比较p〈0.05，#表示与高脂模型组比较p〈0.05，▲表示与血脂康组比较p〈0.05。

组别剂量/（g/kg）HDL-C/TCAI正常 0.40±0.06# 1.54±0.35#▲高脂模型 0.22±0.02* 3.77±0.32*▲血脂康 0.108 0.27±0.02*# 2.74±0.36*#石油醚 1.50 0.23±0.04* 3.50±0.30*乙酸乙酯 1.50 0.23±0.02* 3.72±0.34*正丁醇 1.50 0.25±0.03*# 2.87±0.30*#水1.50 0.23±0.03* 3.96±0.49*

4 结论与讨论

高脂血症又称脂质代谢紊乱或异常，包括血清TC或TG 水平过高或HDL-C 水平过低。本研究采用高脂饲料喂养法建立高脂血症大鼠模型，造模5 周后，大鼠血清 TC、TG、LDL-C 和 HDL-C 含量均显著升高，提示实验性高脂血症大鼠模型建立成功。模型组中HDL-C水平升高原因可能是高脂饲料中加丙硫氧嘧啶所造成的。丙硫氧嘧啶是甲状腺激素抑制药，有研究表明甲状腺激素也可以通过调节SREBP-2 信号通路升高低密度脂蛋白受体（LDL receptor，LDLR）的表达水平从而降低血浆中LDL 的水平[13]。加入丙硫氧嘧啶造成血液中LDL 水平的升高，同时相应增加HDL 的水平，这可能是模型组HDL 水平增高的另外原因。实验结果显示灌胃给药5 周后，4个提取部位对实验性高脂血症大鼠甘油三酯、胆固醇及极低密度脂蛋白均有影响。在降低甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白的作用中，长柄扁桃正丁醇提取部位同血脂康阳性药的药效相类似，可以显著降低高脂血症大鼠血清TC、TG 和HDL-C 的含量，说明长柄扁桃正丁醇提取部位为最佳的降血脂有效活性部位。

MDA 是脂质过氧化反应链终止阶段产生的小分子产物，可严重破坏细胞膜结构，检测MDA 含量可以间接反映机体组织细胞的过氧化程度[14]。高脂模型组大鼠血清中MDA 含量显著升高，体内出现严重脂质过氧化现象。研究发现血脂异常情况下会导致机体抗氧化能力下降，氧自由基生成增加，脂质过氧化作用增强。SOD 是机体细胞中主要抗氧化酶，能清除超氧阴离子使其生成过氧化氢，之后能被过氧化氢酶（catalase from micrococcus lysodeikticus，CAT）分解为水和氧气，是维持生物体自由基产生和过氧化物清除能力平衡的重要物质[14]。SOD/MDA 比值反映自由基引起的脂质过氧化和清除速率，该比值降低，表明机体自身调节无法维持氧化-抗氧化的动态平衡，机体产生脂质过氧化现象[15]。本实验结果显示，血脂康组和长柄扁桃正丁醇提取部位组能够有效抑制高脂血症大鼠血清中MDA 的升高、提高SOD 活力和SOD/NDA 比值，具有增强机体总抗氧化能力。

ALT 和AST 是最常用的肝脏功能的血清酶指标，血清中ALT 和AST 含量越高，表明肝细胞受损越严重[16-17]。本实验高脂模型组血清中ALT 和AST 含量显著升高，表明肝细胞受损。肝系数的增大往往伴随着肝脏过氧化脂质、游离脂肪酸、血清ALT 和AST 升高等，从而引起肝细胞脂肪样变，脂肪代谢紊乱，长期可能引起脂肪肝甚至肝硬化[18]。通过观察各组肝系数可知，与正常组相比，模型组肝系数显著升高，灌胃给药后，长柄扁桃正丁醇部位肝系数显著降低，表明对高血脂症大鼠肝脏起到一定保护作用。ALP 是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，血清中的ALP 主要来自肝和骨骼[19]。ALP在血清中的含量与疾病性质、严重程度相关，ALP 偏高预示着肝脏异常。当肝脏受损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。长柄扁桃正丁醇部位能显著降低高脂血症大鼠血清中的ALT、AST 和ALP 水平，使脂质代谢紊乱引起的大鼠肝脏损伤状况好转，对肝脏有一定的保护作用，这从另一方面说明正丁醇部位具有一定肝脏保护作用，而其具体作用机制尚待进一步的深入研究。

动脉粥样硬化（arteriosclerosis，AS）是严重危害人类健康的疾病，高脂血症能增加动脉粥样硬化疾病发生的几率。在血脂的几个指标中LDL-C 对AS 的发生起着至关重要的作用，它可使胆固醇沉积于动脉血管壁上改变血管之韧性加速AS 的进程。HDL-C 主要将外周组织（包括血管）中的胆固醇及其酯运输至肝脏代谢而排泄。现在已将降低血清LDL-C 和升高HDLC 作为防治的主要措施[20-21]。AS 的治疗效果常以动脉硬化指数（AI）和 HDL-C/TC 比值为评判依据，AI 越低HDL-C/TC 比值越高均表示得到了良好的治疗。从本实验看出模型组的AI 明显升高、HDL-C/TC 比值明显下降。经过给药干预后，长柄扁桃正丁醇提取部位能显著降低高脂血症大鼠血清中AI 指数，显著升高HDL-C/TC 比值，长柄扁桃正丁醇部位是预防动脉粥样硬化形成的有效活性部位。

本研究结果表明，长柄扁桃正丁醇部位能显著降低血清 TC、TG、LDL-C 水平、MDA 的含量、ALT、AST和 ALP 水平、肝系数及 AI 值（p〈0.05），能显著提高SOD活性、SOD/MDA 和 HDL-C/TC 比值（p〈0.05），说明长柄扁桃药材降血脂有效活性部位为正丁醇部位，为进一步开展长柄扁桃降血脂有效部位的量效关系及活性成分分离纯化等研究和寻找其他高效无毒的降血脂药物提供了实验资料。