溴化烷基吡啶盐提取红花脂溶性总黄酮的研究

孟丹,周娜,王鑫,王东伟,魏玲玲,郭颖琼,赵三虎,*

(1.山西师范大学 化学与材料科学学院,山西 临汾 041001;2.忻州师范学院 化学系,山西 忻州 034000)

0 引言

红花又称红蓝花、草红花、刺红花等,属于菊科植物,主要生长在中亚地区,在我国集中分布于新疆、河南、四川等地[1]。红花中含有丰富的药理活性成分,至今已经分离得到包括查尔酮、黄酮苷、生物碱及聚炔类等多种类型的化合物超过 104 种[2-4]。红花中的黄酮类物质被认为是具有生物活性代表性的化学成分,其传统提取方法主要有醇提法[5]、微波辅助法[6]及超声辅助法等[7],这些方法由于提取效率低或对提取设备要求高等原因,为其规模化生产带来很大的不便。基于此,研究红花中黄酮类物质的提取方法备受关注[8-9]。

离子液体(ILs)是一种由有机阳离子和无机阴离子组成的低熔点熔融盐[10]。由于其对有机、无机物具有良好的溶解性，低蒸气压以及低毒等特性,被认为是一种传统有机溶剂的绿色替代品[11-13]。本文根据文献方法合成了6种吡啶类离子盐,并将其水溶液作为萃取剂,在微波辅助作用下提取红花中的脂溶性总黄酮。通过紫外分光光度法与单因素实验相结合的方法探究了影响提取效果的因素,以期发展一种快速提取红花中脂溶性总黄酮的方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器、试剂与材料

UV-2550型紫外可见分光光度计(日本岛津公司),XH-200A型电脑微波固液相合成/萃取仪(北京祥鹄科技发展有限公司),Bruke AVANCE Ⅲ 600 MHz全数字化超导核磁共振谱仪(瑞士布鲁克拜厄斯宾(Bruker Biospin)公司)。

槲皮素标准品(中国预防医学科学院劳卫所)、无水乙醇及其他试剂均为分析纯。实验所用红花产自新疆,干燥粉碎过40目筛后备用。

1.2 实验方法

1.2.1 离子盐的合成

参照文献方法[14],合成了6种吡啶类离子盐:溴化1-乙基吡啶、溴化1-正丁基吡啶、溴化1-正己基吡啶、溴化1-正辛基吡啶、溴化1-正癸基吡啶、溴化1-正十二烷基吡啶。产品结构经1H NMR及13C NMR 光谱表征,结果如下:

溴化1-乙基吡啶:白色晶体,产率91%,熔点117℃;1H NMR(600 MHz,DMSO)δ 9.26(d,J=5.5 Hz,2H,N=CH-),8.65(t,J=7.8 Hz,1H,=CH-),8.21 (t,J=7.0 Hz,2H,=CH-),4.73(q,J=7.3 Hz,2H,=NCH2-),1.56(t,J=7.3 Hz,3H,-CH3);13C NMR (126 MHz,DMSO)δ136.49,123.51,122.22,48.71,35.75,31.23,29.40,28.86,28.79,25.46,22.04,13.88.

溴化1-正丁基吡啶:白色晶体,产率92%,熔点104℃;1H NMR(600 MHz,DMSO)δ 9.31(s,2H,N=CH-),8.65(s,1H,=CH-),8.20(s,2H,=CH-),4.87-4.51(m,2H,=NCH2-),1.90(s,2H,-CH2-),1.27(s,2H,-CH2-),0.91(s,3H,-CH3);13C NMR(126 MHz,DMSO)δ 145.50,144.77,128.04,60.19,32.70,18.66,13.30.

溴化1-正己基吡啶:白色晶体,产率89%,熔点45℃;1H NMR(600 MHz,DMSO)δ 9.23(d,J=5.5 Hz,2H,N=CH-),8.65(t,J=7.8 Hz,1H,=CH-),8.23-8.17(m,2H,=CH-),4.68(d,J=7.4 Hz,2H,=NCH2-),1.97-1.87(m,2H,-CH2-),1.28(s,6H,-(CH2)3-),0.86(d,J=6.7 Hz,3H,-CH3);13C NMR(126 MHz,DMSO)δ 145.98,145.26,128.55,61.28,31.18,31.01,25.48,22.31,14.28.

溴化1-正辛基吡啶:白色晶体,产率90%,熔点29℃;1H NMR(600 MHz,DMSO)δ 9.21(d,J=5.6 Hz,2H,N=CH-),8.65(t,J=7.8 Hz,1H,=CH-),8.23-8.16(m,2H,=CH-),4.67(t,J=7.5 Hz,2H,=NCH2-),2.03-1.86(m,2H,-CH2-),1.33-1.14(m,10H,-(CH2)5-),0.85(t,J=7.0 Hz,-CH3);13C NMR(126 MHz,DMSO)δ145.97,145.25,128.55,61.10,31.59,31.23,28.90,28.81,25.84,22.50,14.40.

溴化1-正癸基吡啶:无色油状黏稠液体,产率87%;1H NMR(600 MHz,DMSO) δ 9.24(s,2H,N=CH-),8.65(d,J=1.0 Hz,1H,=CH-),8.19(d,J=13.4 Hz,2H,=CH-),4.67(t,J=10.4 Hz,2H,=NCH2-),1.94-1.85(m,2H,-CH2-),1.24(m,14H,-(CH2)7-),0.83(t,J=5.3 Hz,-CH3);13C NMR(126 MHz,DMSO)δ 145.97,145.26,128.47,61.06,31.73,31.25,29.34,29.26,29.11,28.87,25.84,22.55,14.40.

溴化1-正十二烷基吡啶:白色固体,产率85%,熔点74℃;1H NMR(600 MHz,DMSO)δ 9.24(s,2H,N=CH-),8.66(s,1H,=CH-),8.20(d,J=7.1 Hz,2H,=CH-),4.69(s,2H,=NCH2-),1.99-1.84 (m,2H,-CH2-),1.25 (d,J=19.8 Hz,18H,-(CH2)9-),0.85 (t,J=7.0 Hz,3H,-CH3);13C NMR(126 MHz,DMSO)δ 145.97,145.26,128.55,61.06,35.61,32.72,31.77,29.48,29.19,28.89,28.55,27.97,25.86,22.56,14.40.

1.2.2 微波辅助吡啶类离子盐水溶液提取红花活性成分

准确称取0.15 g研磨好的红花粉末于鸡心瓶中,加入20 mL 1 mol/L 离子盐水溶液,在400 W,50℃的条件下微波萃取5 min,待样液冷却后,抽滤,将滤液转移到50 mL容量瓶中,用少量离子盐水溶液洗涤容器和残渣,与提取液合并,用离子盐水溶液定容至刻度线。然后从容量瓶中取0.50 mL红花提取样液于10 mL比色管中,用离子盐水溶液定容、摇匀,得到样品溶液。在300～500 nm下对样品进行紫外检测,测其吸光度,计算总黄酮提取量。

1.2.3 传统方法提取

准确称取0.15 g研磨好的红花药材粉末于鸡心瓶中,然后加入20 mL体积分数70% 乙醇,回流提取3 h。待提取液温度降至室温后,抽滤,将滤液转移至50 mL的容量瓶中,用少量70%乙醇洗涤容器和提取后的残渣,将洗涤液与提取液合并,然后用70% 乙醇定容。从容量瓶中取0.50 mL红花提取液,置于10 mL比色管中,然后用70% 乙醇定容,得样品溶液。将样品溶液进行紫外检测,计算总黄酮的提取率。

1.2.4 提取温度的确定

准确称取0.15 g研磨好的红花粉末于鸡心瓶中,加入20 mL 1 mol/L溴化1-癸基吡啶盐水溶液,分别在400 W,40℃、50℃、60℃的条件下微波萃取5 min,待样液冷却后,抽滤,将滤液转移到50 mL容量瓶中,然后再用少量的离子盐水溶液洗涤鸡心瓶和提取后的残渣,与提取液合并,用离子盐水溶液定容。然后从容量瓶中吸取0.50 mL红花提取样液,置于10 mL比色管中,用离子盐水溶液定容、摇匀,得样品溶液。将样液在300～500 nm下进行紫外检测,测其吸光度,计算总黄酮提取量。

1.2.5 提取剂浓度的确定

准确称取0.15 g研磨好的红花粉末于鸡心瓶中,然后分别加入20 mL 0.5 mol/L、1 mol/L、2 mol/L的溴化1-癸基吡啶盐离子盐水溶液于上述鸡心瓶中,在400 W、50℃的条件下微波萃取5 min,待样液冷却后,抽滤,将滤液转移到50 mL容量瓶,用少量离子盐水溶液洗涤鸡心瓶和提取后的残渣,再与提取液合并,用离子盐水溶液定容。然后从容量瓶中吸取0.5 mL红花提取样液,置于10 mL比色管中,用离子盐水溶液定容、摇匀,得样品溶液。在300～500 nm下对样品溶液进行紫外检测,测定其吸光度,计算总黄酮提取量。

1.2.6 DPPH抗氧化实验

首先用无水乙醇配制1×10-4mol/L DPPH溶液,在10 mL比色管中分别移入相同浓度的5.0 mL、5.5 mL、6.0 mL、6.5 mL、7.0 mL的黄酮提取液和Vc溶液,再加入3.0 mL DPPH溶液,定容。把比色管放在黑暗处,避光反应30 min后在517 nm处测它的吸光度。按照下式计算清除率:

DPPH的清除率%=[A0-(A1-A2)]/A0×100

Fig.1 Standard curve of quercetin图1 槲皮素标准曲线

式中:A0为未加黄酮溶液测定的吸光度值;A1为测定液的吸光度值;A2为无DPPH的溶液所测定的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

准确称取10 mg槲皮素标准品,用适量无水乙醇完全溶解,将溶解后的溶液定容到50 mL容量瓶中,得0.2 mg/mL的槲皮素标准品母液。分别移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL槲皮素标准品母液于10 mL比色管中,用无水乙醇定容,用紫外分光光度计测其吸光度,得回归方程:Y=72.86X-0.020 4(R2=0.998 8),槲皮素标准曲线见图1。

2.2 不同离子盐水溶液提取红花脂溶性总黄酮

表1 不同离子盐水溶液提取效果比较

Fig.2 UV absorption of general flavone extracted by different ionic salts solution图2 不同离子盐水溶液提取红花总黄酮的紫外吸收

在微波辅助下,用1 mol/L离子盐水溶液作为提取剂,(不同离子盐水溶液提取红花总黄酮的紫外吸收如图2所示。)与传统乙醇提取法相比,提取率得到了显著提升;6种烷基链长短不同的溴化烷基吡啶类离子盐水溶液都显示了好的提取效果,其中离子盐[C10Py]Br水溶液的提取率最高,提取率达1.98%,高于70%乙醇作为提取剂的0.3%。分析表1中数据,6种烷基链长短不同的溴化烷基吡啶类离子液体水溶液作为提取剂,虽然整体趋势是提取率越来越高,但对提取率的影响呈之字形,当用12个碳的烷基吡啶离子液体作为提取剂时,提取率显著降低。其原因可能是离子液体烷基链长短的变化,影响了溶液的极性,进一步影响黄酮的溶出性;另外烷基链长短发生变化,离子液体的破壁能力也发生变化,二者共同作用,导致提取率呈之字形变化。

2.3 提取温度的确定

表2 温度对[C10Py]Br提取效果的影响

由于红花中主要黄酮在温度60℃以上不稳定[15],所以设置提取温度为40℃、50℃、60℃。由图3和表2可知,溴化1-癸基吡啶盐离子盐水溶液作为提取剂时,50℃为较优温度。

2.4 提取剂浓度的确定

表3 [C10Py]Br的浓度对提取效果的影响

由图4和表3可知,50℃提取红花总黄酮时,[C10Py]Br浓度为1 mol/L时效果最好。

Fig.4 UV absorption of different [C10Py]Br concentration图4 不同[C10Py]Br浓度提取下的紫外吸收

Fig.5 Effect of flavonoids on DPPH free radicals图5 红花黄酮对DPPH自由基的清除效果

2.5 DPPH抗氧化实验结果

实验结果如图5所示,在黄酮浓度为0.029 8～0.038 5mg/mL的范围内,红花中黄酮对DPPH清除能力随着它浓度的增加而减小;黄酮浓度为0.038 5～0.042 0 mg/mL时,黄酮对DPPH的清除能力随其浓度的增大而增大。当黄酮浓度为0.029 8 mg/mL时,DPPH清除率最大,为98.78%,IC50为0.038 6 mg/mL。为了进一步验证离子液体溶剂对清除DPPH的影响,进一步做了有离子液体及无离子液体的Vc溶液对DPPH的清除实验,未见离子液体对Vc溶液清除DPPH有明显影响。虽然红花中黄酮在浓度为0.032 8 mg/mL之后对DPPH清除能力没有抗坏血酸的清除能力高,但红花黄酮对DPPH还是有较强的清除效果。

3 结论

通过单因素实验,探究了吡啶类离子盐水溶液作为提取剂用于红花总黄酮的提取,发现离子盐烷基链的长短、离子盐浓度及提取温度对提取率都有较大的影响,浓度为1 mol/L的[C10Py]Br水溶液作为提取剂,在50℃、微波辅助作用下可有效提取红花中的脂溶性总黄酮。与传统乙醇提取法相比,该方法所用时间短、提取率高。离子液体对提取效果的增强可能是由于其良好的破壁能力及溶出性能,使红花中脂溶性总黄酮溶出更多、更快。DPPH抗氧化实验进一步证明该方法提取的红花总黄酮在低浓度时对DPPH有较强的清除能力。该方法选用了对环境友好的离子盐作为提取剂,不仅高效、便捷,而且易于规模化,是一种可选择的提取红花总黄酮的方法。同时,由于该方法所用时间短、黄酮溶出性高,可用于快速检测红花脂溶性总黄酮的含量,进一步用于红花品质的鉴定。