连翘叶与黄芩有效部位复配物对香肠保鲜研究

汪青波,田叶,田艳花,张立伟*

(1.山西大学 分子科学研究所 化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西 太原 030006;2.山西大学 中医药现代研究中心,山西 太原 030006)

0 引言

肉制品在加工贮藏过程中,由于氧气、微生物等作用,易发生腐败和脂肪氧化,甚至会产生有毒物质[1]。出于保鲜和储存需要,香肠中常加入抗氧化剂和防腐剂以延长其保质期。常用的食品添加剂亚硝酸盐对肉制品虽具有一定的防腐作用,但其易转化生成对人体有害的强致癌物质N-亚硝胺[2-3];同时,出于安全考虑,合成抗氧化剂(BHT、BHA)等在食品工业中的应用也受到限制。目前,正在研究的天然抗氧化剂主要有茶叶提取物、中草药提取物、果蔬提取物、香辛料提取物、维生素类物质、含氮化合物等,其中茶叶提取物茶多酚在肉类产业中已得到广泛应用[4]。相对化学合成抗氧化剂和防腐剂,天然抗氧化剂和防腐剂的毒性要低很多[5-6]。因此,探索和开发低毒性及高效能的天然抗氧化剂、防腐剂依然是前沿研究的热点方向,具有重要现实意义。

连翘为木犀科植物连翘[(Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl)]的干燥果实[7],传统以果实入药,连翘叶为其干燥叶,《中华本草》记载“连翘茎叶,味苦,性寒,主治心肺积热”。连翘叶含有丰富的多酚类物质[8],主要成分为连翘酯苷A、连翘苷等[9-10]。黄芩为唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根[11],为我国传统常用中药,具有清热燥湿、泻火解毒等功效。黄芩的主要化学成分为黄酮类[12],包括黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等。研究表明,连翘叶[13-16]和黄芩[17-18]都具有较强的抗氧化、抗菌活性。目前,关于连翘叶和黄芩提取物在此方面的报道较多,田叶[19]等研究了连翘叶清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺形成及抗氧化活性,结果表明,连翘叶水提取液经D101大孔树脂分离,40%乙醇(体积百分比，下同)洗脱部位总酚含量最高,具有较强的清除亚硝酸盐和抗氧化能力,并能阻断亚硝胺的形成;徐放等[20]采用中草药结合涂膜保鲜技术,比较了鹿蹄草、黄芩、半边莲、黄柏、北豆5种中药提取液及复配制剂对草莓的保鲜作用,结果表明,黄芩提取液的保鲜效果仅次于鹿蹄草提取液,同时黄芩提取液对青霉、灰霉等霉菌的生长也有较强的抑制作用。然而,对于连翘叶及黄芩活性组分的复配在香肠保鲜防腐中的研究应用却鲜有报道。本课题组前期对黄芩清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺形成及抗氧化活性有效部位进行了筛选,结果表明黄芩醇提取液经D101大孔树脂分离,60%乙醇洗脱部位总黄酮含量最高,黄芩素为其主要活性成分,且清除DPPH·、抑制亚硝胺形成及抗菌活性最强,可作为天然抗氧化剂和防腐剂的来源;因此,本论文在前期研究基础上选用连翘叶和黄芩抗氧化有效部位的复配物研究了对香肠抗氧化保鲜作用。

1 实验材料与方法

1.1 材料与试剂

连翘叶采摘于山西省陵川县野生连翘基地,黄芩采挖于山西省陵川县黄芩种植基地,经本校分子科学研究所张立伟教授鉴定分别为木犀科植物连翘[(Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl)]的干燥叶和唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根。

1,1,3,3-四乙氧基丙烷(体积百分比97%)、抗坏血酸钠(麦克林 上海生化科技有限公司);NaCl(优级纯 天津市风船化学试剂科技有限公司);优质猪肉、五香粉、食盐、味精、淀粉购于太原市华联超市;实验用水为娃哈哈纯净水,其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司);先行者CP114万分之一电子天平(美国奥豪斯 上海仪器有限公司);力可美LKM-JR08不锈钢手摇式灌肠机(深圳市力可美科技有限公司);CARY 50紫外分光光度计(美国瓦里安公司);HH-ZK4二列圆孔水浴锅(巩义市予华有限责任公司);pH计(FZ-600复合电极)(成都世纪方舟科技有限公司);DZ500-2D真空包装机(温州市新泰包装机械厂);SHK-99-Ⅱ台式空气恒温摇床(北方同正);高速冷冻离心机(金坛市水北科普实验仪器厂);FSH-2A可调高速匀浆机(金坛市友联仪器研究所)。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备及分析

精密称取100 g连翘叶粉末(过40目筛),依次用料液比1∶10、1∶8的蒸馏水于100℃下回流提取2次,每次1 h[21],冷却、过滤,合并2次滤液于60℃下减压浓缩,冷冻干燥,得连翘叶粗提物。将预处理好的D101大孔树脂湿法装柱,精密称取粗提物10 g,用水溶解、过滤、上样。依次用20%、40%、60%、80%乙醇洗脱,得4个样品组分。经HPLC分析[22],将主要活性成分为连翘酯苷A[19]的40%乙醇洗脱液减压浓缩,冷冻干燥,得连翘叶提取物(Fr)。

精密称取100 g黄芩粉末(过40目筛),用料液比1∶35的53%乙醇70℃下回流提取2 h[23],冷却、过滤,滤液于60℃下减压浓缩,冷冻干燥,得黄芩粗提物。精密称取黄芩粗提物10 g,用乙醇溶解后加入预处理好的D101大孔树脂,依次用水、20%、40%、60%、80%乙醇洗脱,得5个样品组分。经HPLC分析[23],将主要活性成分为黄芩素[24]的60%乙醇洗脱液减压浓缩,冷冻干燥,得黄芩提取物(S)。

1.3.2 样品的复配

前期经过对Fr和S配伍比例为3∶1，1∶1，1∶3的抗氧化、抑菌活性的初步筛选, Fr∶S=1∶3固定比的复配物活性最好; 另外就抑菌活性而言,Fr和S对金黄色葡萄球菌的抑制作用相当,但S对大肠杆菌的抑制作用显著高于Fr,因此选用Fr∶S=1∶3进行样品对香肠保鲜作用的研究。

将1.3.1制备的样品Fr和S,按1∶3的比例混合均匀,得复配样品(FS)。

1.3.3 香肠制作

取肥瘦比例约3∶7的猪后腿肉,剔除淋巴、血管等结缔组织,用绞肉机搅碎,加入质量分数0.01%亚硝酸钠、0.15%味精、0.2%五香粉、2.5%食盐、5%淀粉、10%冰水(均以肉重计),搅匀后分成5组:空白对照组(CT)、阳性对照组、添加0.25%、0.5%、1%复配物,分别标记为T、V、FS1、FS2、FS3。其中,阳性对照组添加0.05%抗坏血酸钠(Vc-Na)。可调高速匀浆机搅匀后于4℃下腌制48 h,真空包装。沸水蒸40 min后冷却,室温(22℃)保存。在第0、1、2、3、4周取样,进行各项指标的测定。

1.3.4 香肠理化指标的测定

1.3.4.1 pH值

参照GB/T 9695.5-2008进行。取10 g香肠研碎后置于具塞锥形瓶中,加入90 mL蒸馏水,25℃恒温摇床上振摇30 min,过滤,测pH值。

1.3.4.2 过氧化值(POV)

标准曲线绘制:采用比色法,参照GB/T 5009.37-2003进行。以吸光度A为纵坐标,Fe2+的浓度(μg/mL)为横坐标,绘制标准曲线,得其线性回归方程y=0.295c+0.000 8(R2=0.999 8),线性检测范围为0.2～4 μg/mL.

样品测定:称2 g香肠样品,加入15 mL三氯甲烷∶甲醇=7∶3混合溶剂,13 000 r/min下均质30 s,加入3 mL NaCl(0.5%)溶液,4℃下3 000 r/min离心10 min。取下层溶液5 mL到具塞比色管中,加入5 mL三氯甲烷∶甲醇=7∶3混合溶剂,加入50 μL FeCl2(3.5 g/L),摇匀后加入50 μL硫氰酸钾(300 g/L),混匀,静置5 min,于500 nm处测吸光度值。

1.3.4.3 硫代巴比妥酸值(TBA)

采用分光光度法,参照GB 5009.181-2016进行。以吸光度A为纵坐标,丙二醛的浓度(μg/mL)为横坐标,绘制标准曲线,得其线性回归方程y=0.779 8c+0.000 5(R2=1),线性检测范围为0.018～0.627 μg/mL.

1.3.4.4 挥发性盐基氮(TVB-N)

采用半微量定氮法,参照GB 5009.228-2016进行。称取10 g样品置于250 mL具塞锥形瓶中，加入100 mL去离子水，摇匀，静置30 min后过滤。取滤液10 mL于半微量凯氏定氮装置的小玻管中，再加入5 mL氧化镁混悬液(10 g/L)，同时向接受瓶内加入10 mL硼酸溶液(20 g/L)和5滴混合指示剂(1 g/L甲基红乙醇溶液与1 g/L的溴甲酚绿乙醇溶液按1∶5混合)蒸馏1 min。以0.01 mol/L的盐酸标准溶液滴定到紫红色。根据消耗盐酸的量计算挥发性盐基氮的含量(TVB-N)。

1.3.4.5 亚硝酸盐的测定

采用分光光度法,参照GB 5009.33-2010进行。以吸光度A为纵坐标,NaNO2浓度(μg/mL)为横坐标,绘制标准曲线,得到线性回归方程y=0.751 8c+0.003 1(R2=0.999 8),线性检测范围为0.02～0.22 μg/mL.

1.3.4.6 数据统计与处理

2 结果与分析

2.1 pH值随贮藏时间的变化

pH值是评价肉制品品质的指标之一,肉制品酸败会导致pH值降低,严重影响肉制品品质及保质期。表1显示了香肠pH值随贮藏时间的变化,空白对照组、Vc-Na组、样品组pH值都随贮存时间延长而逐渐下降。其中,pH值在第0～1周下降较快,具有显著性差异(P<0.05),这可能是由于香肠中蛋白质分解为氨基酸或碳水化合物分解成有机酸导致[25];在第2～4周,各组pH值下降速度减缓,可能是随贮藏时间延长,蛋白质分解酶活性增强,蛋白质被分解为氨或碱性胺类物质。相比空白组,样品组pH值下降速度较慢,表明FS样品具有延缓香肠酸败的作用;同时,较高的pH环境可抑制香肠中致癌物质亚硝胺的形成[26],保障了香肠的质量安全。另外,在同周期下,样品组pH值为FS3>FS2>FS1,表明FS对香肠酸败的抑制作用与剂量呈正相关。本研究表明,FS样品能有效延缓香肠中蛋白质及碳水化合物的分解酸化,对香肠具有较好的保鲜作用。

表1 pH值的变化

2.2 POV值随贮藏时间的变化

氢过氧化物是不饱和脂肪酸氧化的初级产物[27],POV值越大,脂肪氧化程度越高,生成的氢过氧化物越多。氢过氧化物不稳定,易进一步降解成醛、酮和酸等物质[28],从而影响香肠品质。

表2显示,空白对照组、Vc-Na组和样品组POV值都随贮藏时间延长而升高;其中,第0～1周氧化速度缓慢,各组POV值无显著差异(P>0.05);第2～4周,各组POV值显著升高,原因可能是:脂肪氧化反应是自由基链式反应,包括引发、传递和终止三个阶段,第1周属于引发阶段,氧化速度相对缓慢,第2周进入传递阶段,脂肪氧化速度迅速加快。分析发现,从第3周开始,样品组和Vc-Na组POV值较空白组显著降低;在第4周,样品中、高剂量组POV值还显著低于Vc-Na组(P<0.05),这说明复配样品和Vc-Na都能显著抑制脂肪的氧化,同比下,样品中、高剂量组抑制作用强于Vc-Na。比较样品组POV值差异可知,样品对脂肪氧化的抑制作用与剂量呈正相关。

表2 POV值的变化(单位:meq/kg)

2.3 TBARS值随贮藏时间的变化

TBARS用于测定肉制品中丙二醛含量,是评价肉制品中脂肪氧化程度的另一种方法。与POV类似,其值越大,脂肪氧化程度越高。脂肪氧化会导致肉制品脂肪酸和脂溶性维生素严重损失,是肉制品贮藏过程中品质恶化的一个主要原因。

从表3可知,随贮藏时间延长,各组TBARS值升高,说明脂肪氧化程度随贮藏时间增加而增强。在第0～1周,各组TBARS值上升较慢,此阶段可能为脂肪初级氧化产物生成阶段。在1～3周,各组(FS3除外)TBARS值上升较快,此阶段可能是由于过氧化物积累,分解速度加快导致。比较第4周TBARS值可知,Vc-Na组和样品组TBARS值均显著小于空白组(P<0.05),且样品组剂量越大,TBARS值越小,表明Vc-Na及复配样品均可抑制香肠中脂肪氧化次级产物的形成,且复配样品对脂肪氧化的抑制与剂量呈正相关。在第3～4周,样品中、高剂量组TBARS值均显著小于Vc-Na组(P<0.05),说明随贮藏时间的延长,样品中、高剂量组对脂肪氧化次级产物形成的抑制作用强于Vc-Na组。

表3 TBARS值的变化(单位:mg/kg)

2.4 TVB-N值随贮藏时间的变化

TVB-N是指在内源酶和细菌作用下,肉制品中的蛋白质被分解成的挥发性氨及胺类(二甲胺、三甲胺)等含氮碱性物质,一定量生物胺对人体具有重要的生理功能[29],但含量过高则会起毒害作用[30]。TVB-N含量与肉制品腐败程度具有一定相关性,是衡量肉制品腐败变质的重要指标之一。

从表4可知,随贮藏时间的延长,各组TVB-N值逐渐增大。与空白组相比,Vc-Na组在第1周有显著性差异(P<0.05),2～4周差异不明显(P>0.05),表明Vc-Na在第1周延缓了香肠中蛋白质的腐败,但由于Vc-Na不稳定,随着时间延长逐渐失活,故在2～4周TVB-N值快速增大,这也反映了Vc-Na抑菌作用不明显。在1～4周样品组与空白组的TVB-N值差异显著(P<0.05),说明样品有效抑制了香肠中蛋白质的分解;比较样品组间TVB-N值的差异可知,样品对蛋白质分解的抑制能力与剂量呈正相关。第4周时,样品中、高剂量组的TVB-N值均显著小于Vc-Na组(P<0.05),说明样品中、高剂量组对抑制蛋白质分解的能力强于Vc-Na组。

表4 TVB-N值的变化(单位:mg/kg)

2.5 亚硝酸盐含量随贮藏时间的变化

亚硝酸盐作为肉制品添加剂历史悠久,但它的安全性一直受国内外广泛关注。在酸性条件下它会分解成亚硝酸,亚硝酸又易分解成亚硝基,而亚硝基能与蛋白质分解产物仲胺类物质反应生成亚硝胺[31]。亚硝胺具有致癌作用,所以亚硝酸盐含量是评价香肠品质的重要指标之一。

从表5可知,随着贮存时间延长,各组亚硝酸盐含量逐渐降低,值得注意的是:在0周,Vc-Na组、样品组中的亚硝酸盐含量显著低于空白组(P<0.05),说明Vc-Na、样品均可减少香肠中的亚硝酸盐含量,且样品对亚硝酸盐的清除作用呈剂量依赖关系。在贮藏期间样品中、高剂量组亚硝酸盐的含量显著低于Vc-Na组(P<0.05),可知样品中、高剂量组对亚硝酸盐的清除作用强于Vc-Na组。同时Vc-Na组和复配样品组中亚硝酸盐含量的减少,也有利于抑制香肠中亚硝胺的形成。

表5 亚硝酸盐含量的变化(单位:mg/kg)

3 结论

本文通过对香肠各项理化指标pH值、POV值、TBA值、TVB-N值和亚硝酸盐含量的测定来评价连翘叶及黄芩提取物经分离后抗氧化有效部位的复配对香肠的抗氧化保鲜作用。研究表明,不同剂量(0.25%、0.5%、1%)Fr与S复配样品能有效抑制香肠各理化指标含量的增加,且保鲜程度与剂量呈正相关,同比下,样品中、高剂量组作用强于阳性对照Vc-Na组,对香肠具有较好的防腐作用,从而延长香肠的保质期。因此,本研究为探索和开发高效、安全的天然抗氧化剂具有重要指导意义,同时对连翘资源的深度开发利用提供了理论支持。