新生大鼠哺乳期间断吸入七氟烷对老年期行为学及海马ApoE的影响*

吴振宇，谢 笛，唐春春，朱宇航，朱昭琼△

(1.遵义医学院附属医院麻醉科，贵州遵义 563000；2.贵州省麻醉与器官保护基础研究重点实验室，贵州遵义 563000；3.贵州省遵义市第一人民医院ICU，贵州遵义 563000)

婴幼儿时期是大脑发育的关键时期，该时期机体的中枢神经系统对于内外环境的变化异常敏感[1]。小儿智力发育状况直接关系其未来成长的远期结果，但由于疾病、创伤、意外等多重风险因素的存在，不同年龄的小儿可能面临需要在全身麻醉下进行一次或多次的医学检查及治疗。目前已有研究表明老年患者接受七氟烷麻醉后可出现显著持久的认知功能障碍[2]。但临床常用小儿全身麻醉药七氟烷麻醉后，对婴幼儿时期大脑发育及远期的认知功能的影响目前鲜有报道。载脂蛋白E(apolipoprotein-E，ApoE)及其基因型的异常表达是目前较为公认的影响老年期认知功能的重要因素[3]，然而对其他年龄段影响不明。故本实验观察哺乳期大鼠间断吸入七氟烷麻醉后，哺乳期、老年期行为学变化及海马ApoE变化差异，探讨间断吸入七氟烷麻醉影响大鼠海马ApoE变化与不同时期认知功能的改变，并探索其机制。

1 材料与方法

1.1主要药品、试剂与仪器 七氟烷(批号：65130704，山东鲁南贝特制药有限公司)；ApoE一抗(北京奥博森生物技术有限公司)；GTVision Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫组织化学试剂盒(上海基因科技有限公司)；Trizol、PrimeScript RTReagent Kit(TaKaRa公司，日本)；iQ SYBR GreenSupermix(Bio-Rad公司，美国)；Fabius麻醉机、Va-mos气体监测仪(Draeger公司，德国)；自制吸入麻醉箱；Morris水迷宫测试仪(成都泰盟科技有限公司)；显微镜(Olympus公司，日本)；CFX荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪(Bio-Rad公司，美国)。

1.2动物选择及分组 新生7日龄SD大鼠48只，雌雄不拘，由重庆第三军医大学实验动物中心提供[SCXK(渝)2012-0005]。依照体质量及大鼠年龄采用随机数字表法分为4组，即间断七氟烷麻醉哺乳期(P0～P37)组(Sev1组，n=12)、哺乳期对照组(Con1组，n=12)、间断七氟烷麻醉老年期(P600～P606)组(Sev2组，n=12)及老年期对照组(Con2组，n=12)。Sev1、2组分别于出生后第7天(P7)、第14天(P14)、第21天(P21)经七氟烷处理：将自制吸入麻醉箱(75 cm×40 cm×15 cm)进、出气口连接麻醉机及气体监护仪，调节气体流量及七氟烷挥发罐完成箱内气体平衡，待进出气口七氟烷浓度稳定于2.6%后放入大鼠，并维持2.6%七氟烷浓度麻醉2 h；Con组在上述时间点分别吸入空氧混合气体(空气1 L/min+ O21 L/min)2 h。麻醉结束待自然苏醒后放回原饲养笼喂养。饲养环境相对湿度50%～60%，温度20～24 ℃，自然昼夜循环光照，母乳喂养。

1.3认知功能测定 Sev1组、Con1组于第31～37天进行Morris水迷宫实验，包括l d的适应性训练、5 d的定位航行实验和1 d的空间探索实验。定位航行实验：每天4次，将平台设置为低于水面1.5 cm。依次从4个象限的盆壁中点将大鼠面向盆壁放入水中，以大鼠120 s内找到并爬上平台时间记录为逃避潜伏期。若120 s内没有找到平台，则指引其找到并置于平台上休息20 s后再次实验。若大鼠3次均未能爬上平台，将予以剔除。空间探索实验：实验第6天，撤去平台，大鼠从原平台象限的对侧象限入水，游泳120 s，记录原平台象限滞留时间百分比，原平台象限运动距离百分比，原平台象限进入次数百分比。Sev2组(n=12)、Con2组(n=12)于20个月完成上述相同实验。

1.4海马ApoE mRNA表达的检测 水迷宫实验结束后立即取材，每组各6只腹腔注射1%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉后取海马组织，置于0.5 mL Trizol液中，用研杵充分匀浆至组织完全裂解，加入氯仿0.2 mL，快速摇匀，4 ℃以12 000 r/min离心10 min，取出上清液，加0.2 mL异丙醇摇匀后，室温静置10 min，4 ℃以12 000 r/min离心10 min，弃上清液。加入75%乙醇0.5 mL，4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，弃上清液。将EP管倒置于滤纸上室温下自然干燥，以去酶水50 μL溶解。采用紫外分光光度计测定吸光度值(A260/A280)。根据GenBank中目的基因全序列，使用Primer Premier5.0软件自行设计引物，ApoE mRNA上游引物：5′-GTG CAG ACG CTT TCT GAC C-3′,下游引物：5′-CTT CCG TCA TAG TGT CCT CCA TC-3′。荧光定量PCR反应体系为ddH2O 7.6 μL,SYBR 10 μL,上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，DNA模板1.6 μL，每管共计20 μL。PCR反应条件：95.0 ℃预变性10 s；95.0 ℃ 5 s，60.6 ℃ 20 s，循环40次；55.0 ℃开始，每0.5 ℃采集10 s荧光。采用2-△△CT法计算目的基因的相对表达水平。

1.5海马ApoE、ApoE4表达的检测 水迷宫结束后立即取材，将两组实验动物每组各6只，腹腔注射1%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉后处死，取出脑组织置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后石蜡包埋切片、脱蜡、复水、抗原修复，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后加一抗。次日复温，PBS冲洗3次后孵育二抗，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。400倍光镜下进行半定量分析，每张切片选取海马CAl区、CA3区和DG区，每区选取4个视野，采用Image-Pro Plus6.0图像分析软件检测144个(1蛋白×12标本×3区×4视野=144)视野A值，以平均A值反映ApoE、ApoE4的表达水平。

2 结 果

2.1水迷宫实验结果

2.1.1定位航行实验 随实验时间增加，各组大鼠逃避潜伏期呈缩短趋势，其中Sev1组与Con1组比较差异无统计学意义(P>0.05)。实验数据第3天Sev2组大鼠与Con2组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、2。

图1 哺乳期组大鼠定位航行实验逃避潜伏期比较

2.1.2空间探索实验 Sev1组与Con1组相比较，Sev2组与Con2组相比较，原平台象限滞留时间百分比、原平台象限运动距离百分比、原平台象限进入次数百分比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2荧光定量PCR结果 Sev1组与Con1组比较，Sev2组与Con2组比较，大鼠海马ApoE mRNA表达均明显上调(P<0.05)。见表2。

2.3免疫组织化学实验结果

2.3.1大鼠海马ApoE蛋白表达结果 与Con1组比较，Sev1组海马CAl区和CA3区ApoE表达上调(P<0.05)，DG区ApoE表达差异无统计学意义(P>0.05)。与Con2组比较，Sev2组大鼠海马各分区ApoE蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

a：P<0.05，与Con2组比较

图2 老年期组大鼠定位航行实验逃避潜伏期比较

表2 海马ApoE表达水平比较

a：P<0.05，与Con1组比较；b：P<0.05，与Con2组比较

2.3.2大鼠海马ApoE4蛋白表达比较结果 Sev1组与Con1组比较，Sev2组与Con2组比较，大鼠海马各分区ApoE4蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

组别CA1区CA3区DG区Sev1组0.197±0.0310.202±0.0180.192±0.026Con1组0.198±0.0210.203±0.0270.152±0.016Sev2组0.124±0.0360.134±0.4220.152±0.072Con2组0.115±0.0150.142±0.0470.132±0.048

3 讨 论

全身麻醉与认知功能变化的研究一直是医学界的热点话题。七氟烷因其药理特性的优势，已成为小儿全身麻醉药的常用药物之一。小儿由于语言表达能力、客观事物反应能力的受限性，围术期通常难以配合医务人员或学者的观察，所以目前的临床研究中罕有小儿经麻醉后出现认知功能障碍的报道。然而患儿家长及学者们依然担心全身麻醉会对小儿未来的认知能力产生影响。目前临床应用于婴幼儿的七氟烷浓度为2.6%左右[4]，且七氟烷的临床99%有效浓度为1.3 MAC，通过换算，浓度也为2.6%。而新生期大鼠七氟烷最低肺泡有效浓度(minimum alveolar concentration，MAC)值约2.0%[5]。故参考文献[6]，本研究于新生大鼠7、14、21 d间断重复吸入2.6%七氟烷麻醉建立动物模型，以模拟临床上接受七氟烷麻醉患儿，观察近期及远期行为学相关的变化，并探讨其可能机制。

目前用于检测认知功能经典的行为学方法是Morris水迷宫实验，参照文献[7]，本研究采用Morris水迷宫实验检测哺乳期及老年期大鼠认知功能。本实验中未发现先天愚型大鼠。定位航行试验检测大鼠陈述性记忆能力，陈述性记忆属于外显记忆，海马和内侧颞叶是其核心脑区[8]。由Morris水迷宫实验可发现，其与逃避潜伏期呈负相关[9]，即陈述性记忆能力强，则逃避潜伏期短。逃避潜伏期延长，反映大鼠陈述性记忆能力受到损害。本实验结果显示，哺乳期大鼠逃避潜伏期随训练时间增加呈缩短趋势，组间比较差异无统计学意义。老年期大鼠逃避潜伏期随时间增加呈缩短趋势，定位航行实验第3天Sev2组逃避潜伏期相对Con2组时间延长(P<0.05)，但随着训练时间的增加，两组大鼠逃避潜伏期差异无统计学意义。空间探索实验主要检测空间联想和回忆能力[10]，是对之前定位航行实验中记忆信息的再提取。本研究发现，哺乳期大鼠、老年期大鼠原平台滞留时间百分比、原平台运动距离百分比、原平台进入次数百分比差异均无统计学意义(P>0.05)。表明吸入2.6%七氟烷麻醉对核心脑区的记忆输出功能并不造成影响。本研究行为学实验表明，新生期大鼠间断七氟烷麻醉对其老年期陈述性记忆可能存在影响，但这种影响随着训练时间的增加是可逆的，对大鼠的记忆提取能力没有影响。

目前，国内外均有研究表明ApoE及其基因型是发生认知功能障碍的易感基因，也是引起阿尔茨海默病(AD)的危险因素，其与认知功能障碍的慢性演化甚至进展为AD密切相关[11-12]。ApoE分为3种亚型，分别为ApoE2、ApoE3及ApoE4。有研究发现，中枢神经系统中，ApoE作为胆固醇载体运输的脂质对轴突生长有重要作用，ApoE4可降低脑中脂质代谢水平并导致脂质异常，从而促进认知障碍的发生[13]。HANSON等[14]研究也指出，ApoE与Aβ的清除代谢密切相关，Aβ是大脑“老年斑”形成的重要诱因，ApoE可通过分子伴侣的形式与Aβ结合，影响星形细胞和神经元对Aβ的清除，导致老年斑形成和神经细胞凋亡，从而引起认知功能障碍，且Apo4携带者清除能力弱于Apo3，故Apo4更易引起Aβ的沉积，使海马/脑内的“老年斑”沉积增加，进而促进认知功能障碍的发生。本研究中发现，间断吸入2.6%七氟烷后，哺乳期、老年期海马ApoE mRNA表达均明显上调(P<0.05)。ApoE mRNA是蛋白质合成的模板，在ApoE的生成过程中有重要作用，故ApoE mRNA表达量的增高可能提示局部组织蛋白质的变化。进一步对比各组大鼠海马各分区ApoE蛋白表达变化发现，Sev1组大鼠CA1区、CA3区ApoE蛋白表达水平较Con1组明显上调(P<0.05)。海马CA1区是学习记忆信号在海马的主要输出区域[15]。CA3区是联想记忆产生的重要脑区，分为自联想和异联想记忆[16]。而Sev2组大鼠海马各分区ApoE蛋白表达水平比较差异无统计学意义。再进一步分析大鼠海马各分区ApoE4蛋白表达比较分析差异无统计学意义(P>0.05)。通过对比发现，间断吸入七氟烷后，短期内可以导致大鼠海马ApoE上调，提示间断吸入七氟烷有产生一过性神经毒性及认知功能障碍的可能性，但随着时间的增加，这种神经毒性可以通过某种途径自行被消除。分析其原因可能与ApoE基因多态的功能特异性有关，本课题组前期研究表明ApoE2等位基因与AD的危险性下降有关[17]。也有研究指出ApoE3可增加Tua蛋白的稳定性，促进神经元的生长等[18]。故推测哺乳期大鼠接受间断七氟烷麻醉后，其可能存在ApoE2、ApoE3表达的升高，可能与认知功能障碍的产生呈负相关。这种ApoE多态性基因的相互作用也可能与七氟烷暴露时间及浓度存在相关性。且本实验中哺乳期及老年期大鼠ApoE4检测未见异常表达，可以认为不必担心有与此机制相关的认知障碍发生。本实验中哺乳期大鼠间断2.6%七氟烷麻醉虽然在大鼠幼年期引起了海马ApoE改变，但未造成老年期大鼠海马ApoE异常及明显行为学改变，提示该浓度七氟烷麻醉对发育中大鼠大脑的影响是短暂性的，并不影响远期行为学。文献[19]的观点与本实验结果一致。这也符合朱霞等[20]认为七氟烷影响认知功能的效应是短期的、一过性的推测。

综上所述，哺乳期大鼠间断2.6%七氟烷麻醉后，可对大鼠海马ApoE产生短暂影响，但并不足以造成大鼠老年期海马ApoE异常及明显的行为学改变，可为临床使用该浓度七氟烷提供参考。同时本研究也存在一定不足之处，笔者将进一步探究新生期及老年期大鼠吸入七氟烷后海马ApoE多态性的变化，以及对其他认知功能相关基因及蛋白进行进一步定性、定量分析，更深层次地探讨七氟烷吸入麻醉与认知功能改变的相关机制。