中空纤维膜液相微萃取-超高效液相色谱测定蒙药毛勒日-达布斯-4汤中两种生物碱

宝贵荣, 孟 和, 李优鑫, 包建民*

(1. 呼和浩特职业学院生物化学工程学院, 内蒙古 呼和浩特 010051; 2. 天津大学药物科学与技术学院, 天津 300072; 3. 内蒙古大学化学化工学院, 内蒙古 呼和浩特 010021)

蒙药毛勒日-达布斯-4汤是在蒙医临床中常用的传统蒙药制剂,是由光明盐、诃子、荜茇和干姜各125 g组成的散剂。毛勒日-达布斯-4汤制剂通常是浅棕黄色至棕黄色粉末,具有温胃、消食、解毒的功效。临床常用于治疗消化不良、胃胀、药物中毒和食物中毒等。蒙药毛勒日-达布斯-4汤的主要活性成分为胡椒碱和荜茇宁,准确测定这些活性成分有助于该蒙药走向现代化。虽然已有报道[1,2]用HPLC方法测定蒙药毛勒日-达布斯-4汤中胡椒碱的含量,但该方法灵敏度不高。特别是当这些活性物质处于复杂样品基质中且又是痕量的时候,就需将分离、富集等样品前处理技术与定量检测技术(如液相色谱)结合起来,以增加检测的灵敏度和准确度。因此,有必要开发更加广泛应用的样品前处理技术并同时测定胡椒碱和荜茇宁的分析方法。

中空纤维膜液相微萃取(HF-LPME)技术是集采样、萃取和浓缩于一体的样品前处理方法。该技术具有微量、快速、环境友好、操作简便、廉价等优势,克服了传统样品前处理的诸多不足[3],广泛应用于药品、环境等领域微痕量成分的分析测定[4]。HF简便易得,在分析领域应用广泛。但是HF种类太多,材质、直径大小、壁厚、空隙率等的不同都会影响最终的萃取效果。正是因为HF这种多样性,到目前为止,尚无一家商业化的液相微萃取装置可以采购。这种非商业化限制了该技术的广泛应用。因此,搭建HF-LPME装置成了该领域研究的热点。本文介绍一种实验室自制装置,将移液枪的枪头剪短后用环氧树脂胶粘在HF和瓶盖之间,制成半自动化的HF-LPME装置,用于监测蒙药毛勒日-达布斯-4汤时的样品前处理,与UPLC联用,测定蒙药毛勒日-达布斯-4汤中胡椒碱和荜茇宁的含量。同时考察了影响HF-LPME效率的参数,并优化了色谱条件。此方法操作简便、灵敏度高,可显著提高检出限,为蒙药毛勒日-达布斯-4汤中生物碱的分析提供了新方法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Waters ACQUITY UPLC、ACQUITY Ultra Performance二极管阵列检测器(PDA)、Milli-Q超纯水装置(美国Millipore公司), KQ-300VDE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司), AnkeTDL-5-A型离心机(上海安亭科学仪器厂)。偏氟乙烯HF1(简称PVDF1, i. d. 1.57 mm, o. d. 1.96 mm, 23%空隙率)和偏氟乙烯HF(简称PVDF, i. d. 1.60 mm, o. d. 2.02 mm, 54%空隙率)购于安徽百奥秘科生物医药研究院,聚丙烯HF(简称PPHF, i. d. 0.50 mm, o. d. 0.80 mm, 0.2 μm空隙率)购于天津工业大学。

蒙药毛勒日-达布斯-4汤由内蒙古国际蒙医院提供;胡椒碱(纯度98.0%)购自北京恒元启天化工技术研究院;荜茇宁(纯度99.0%)由内蒙古大学蒙药化学研究所提供;甲醇和乙腈(均为色谱纯)购自天津大学科威公司;其他试剂均购自天津北联精细化学品开发公司。

1.2 溶液配制

标准溶液:分别准确称取20 mg胡椒碱和10 mg荜茇宁对照品,用无水甲醇溶解并定容至50 mL,得到胡椒碱和荜茇宁的标准储备液,于4 ℃冰箱避光保存。工作溶液由标准储备液稀释至所需浓度。

样品制备:取蒙药毛勒日-达布斯-4汤散剂,研细,过80目筛子,取0.40 g,用95%(体积分数)乙醇超声(270 W, 45 kHz)提取40 min后冷却,定容至25 mL,揺匀后转至塑料离心管中,以4 000 r/min的速度离心15 min,吸取上清液,过滤膜。

1.3 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美国Waters公司);柱温为40 ℃;进样量为2 μL;流动相为乙腈和水(45∶55, v/v);流速为0.18 mL/min;检测波长为338 nm。

1.4 HF-LPME

自制的HF-LPME装置见图1。将HF剪成30 mm长,放入甲醇中超声清洗,自然晾干。将HF的一端加热封死,另一端连接在移液枪的枪头外部。为了避免HF脱落,使用环氧树脂胶粘在HF与枪头之间,枪头的另一端剪短后固定在样品瓶盖的中间部位,并用微量注射器注入25 μL正辛醇。取1.8 mL样品溶液加入HPLC自动进样瓶中,将含正辛醇的HF放入此小瓶。在室温以173 r/min的速度振荡萃取128 min。萃取完毕,用微量注射器抽回5 μL正辛醇,并放入干净的HPLC自动进样瓶中,在37 ℃用氮气吹干。残渣以300 μL的甲醇复溶后过滤,滤液和给体相用UPLC分析。

图 1 HF-LPME装置Fig. 1 Hollow fiber liquid phase micro-extraction(HF-LPME) device

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

对UPLC流动相的比例和流速进行考察,结果见表1。以分离度最佳为选择标准,选择流动相为乙腈和水(45∶55, v/v),流速为0.18 mL/min。

表 1 流动相体积比及流速对保留时间和分离度的影响

2.2 HF-LPME条件的优化

2.2.1HF的选择

HF具有疏水性,并有一定的机械强度[5]。为得到更好的萃取效率,对3种HF(PVDF1、PVDF和PPHF)进行了筛选。结果(见图2a)表明,空隙率>50%的PVDF萃取效率最高,因此本试验选用PVDF做HF。

图 2 HF-LPME条件的优化(n=5)Fig. 2 Optimization of HF-LPME conditions (n=5)a. selection of hollow fiber; b. selection of extraction solvent; c. selection of salt mass concentration; d. selection of extraction time. PVDF: polyvinylidence fluoride HF; PPHF: polypropylene HF.

2.2.2有机溶剂的选择

HF-LPME中选择合适的有机溶剂至关重要。有机溶剂不仅要与HF有良好的亲和力,且需具有疏水性、低挥发性以及适当的黏度[6,7]。考察了正丁醇、正戊醇、正己醇、正己烷、正辛醇等有机溶剂对药物萃取效率的影响,结果见图2b。正辛醇的萃取效率最好,其次是正己烷,但正己烷易挥发。因此,选用正辛醇为萃取溶剂。

2.2.3离子强度的选择

HF-LPME中有机溶剂和样品溶液之间的分配系数受样品基体的影响,样品溶液中加入无机盐可增强溶液的离子强度[8]。通过向样品溶液中加入0～20 g/L的氯化钠来考察离子强度对胡椒碱和荜菝宁萃取效率的影响,结果见图2c。结果表明,目标物的峰面积随氯化钠质量浓度的增加而增加,氯化钠质量浓度为10 g/L时达到了最高值,随后峰面积逐渐降低,因此选择在样品溶液中加入10 g/L的氯化钠。

2.2.4萃取时间的选择

HF-LPME是基于物质传质速率和萃取分配平衡的过程。萃取达到平衡时,待测物的萃取效率最高[9,10],但萃取时间过长,有机溶剂挥发且溶解,影响萃取效率。本文考察了萃取时间对胡椒碱和荜菝宁萃取效率的影响,结果见图2d。随着萃取时间的增加,萃取效率增加,萃取2 h时基本达到平衡。综合考虑,选择萃取时间为128 min。

2.3 方法学研究

在优化条件下,分析线性范围、检出限、重现性,计算加标回收率。配制不同质量浓度标准溶液,以标准溶液质量浓度(X, μg/L)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归。胡椒碱和荜菝宁分别在100～8 500和8.3～5 000 μg/L范围内线性关系良好,相关系数大于0.996 7。按照3倍信噪比和10倍信噪比确定化合物的检出限(LOD)和定量限(LOQ),结果见表2。胡椒碱和荜菝宁的检出限为2.2和2.5 μg/L,定量限为7.3和8.3 μg/L,日间精密度为5.8%和7.8%,日内精密度为2.6%和3.1%。分别取20、250和500 μg/L 3个水平的加标样品溶液,在最佳HF-LPME萃取条件下平行测定5次,用外标法计算胡椒碱和荜菝宁含量,实验结果表明,该方法重现性良好。

表 2 线性范围、相关系数(r2)、检出限、定量限、富集倍数(EF)和标准偏差(n=5)

a. 500 μg/L aqueous solutions were measured every 2 h in a day (n=5); b. 500 μg/L aqueous solutions were measured once a day (keep away from light) (n=5).

图 3 胡椒碱和荜菝宁标准溶液和样品溶液的UPLC谱图Fig. 3 UPLC chromatograms of piperine and piperlonguminine standard solution and sample solution

将本方法与蒙药毛勒日-达布斯-4汤中胡椒碱含量测定方法[1,2]相比较,结果表明,该方法的检测限优于文献报道的结果。

2.4 实际样品分析

取3批样品,按1.2节方法制备样品溶液。在优化条件下,以外标法测定并计算样品中胡椒碱和荜茇宁的含量。蒙药毛勒日-达布斯-4汤中胡椒碱和荜菝宁的含量分别为(80±1.28) μg/L和(4.16±0.36) μg/L, RSD均小于6.6%(n=3)。标准溶液和样品溶液的色谱图见图3。

3 结论

本文通过对色谱条件和液相微萃取条件的优化,建立了HF-LPME-UPLC联用测定蒙药勒日-达布斯-4汤中2种生物碱含量的方法。本方法操作简便、灵敏度高、具有富集倍数高、重现性好等优点,可广泛用于蒙药中胡椒碱和荜菝宁的同时测定。