黑骨藤对坐骨神经损伤大鼠的保护作用*

王 恒，吉杨丹，王燕林，党荣敏，余跃生，沈祥春

(1.黔南民族医学高等专科学校，贵州都匀 558003；2.贵州医科大学天然药物资源优效利用重点实验室，贵阳 550025)

周围神经损伤(peripheral nerve injury，PNJ)是临床上的常见疾病，其发生与周围神经干或其分支受到外界直接或间接力量作用损伤有关，因具有病程长、损害大、治疗困难等特点[1]，受损后的神经修复与再生过程复杂，目前西药治疗PNJ疗效局限[2]。民族药中含有的治疗PNJ药物，因其具有疗效确切、不良反应小、多靶点作用等优点，近年来倍受国内外学者关注。黑骨藤为萝藦科，杠柳属植物黑龙骨的干燥根或全株，具有活络、通经、祛风、解毒等药效。苗族药名为蛙莽塞，是贵州苗族地区民间广泛用于闭合性软组织损伤、风湿与类风湿等疾病的民族药，有“万藤之王”之美誉[3]。本课题组的前期研究发现，黑骨藤具有抗急性痛风作用及修复线虫因热刺激引起的神经损伤，对神经疼痛治疗和修复神经损伤有一定疗效[4-5]。因此本研究建立大鼠坐骨神经夹持损伤模型，检测黑骨藤对大鼠坐骨神经功能指数(sciatic functional index，SFI)及大鼠血清中炎性细胞因子表达的影响，探讨黑骨藤对坐骨神经损伤(sciatic nerve injury，SNI)的作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 健康清洁级SD大鼠120只，雄性，体质量280～320 g，由贵州医科大学动物实验中心提供。动物合格证号SCXK(黔) 2012-0001。实验前置于室温18～22 ℃，相对湿度65%，光照周期12 h，适应性喂养3 d。

1.1.2主要仪器与设备 R-210型旋转蒸器购自瑞士BUCHI公司，电炉、电热恒温水浴锅购自上海越进医疗器械一厂，DZF-4型真空干燥箱购自上海医用恒温设备厂，TDL-4ZB型台式低速离心机购自湖南星科科学仪器厂，DG530酶联免疫检测仪购自华东电子集团医疗装备有限公司，KJ-210A型振荡器购自姜堰康健医疗器具有限公司，TS-100型摇床购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司，BS223型电子天平购自北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.1.3药物与试剂 黑骨藤饮片购于贵州同济堂制药有限公司(由贵州医科大学龙庆德副教授鉴定为西南杠柳黑骨藤的全株)，70%乙醇提取，提取率1.45%。白细胞介素(IL)-1、IL-6及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA检测试剂盒批号为201611，均为武汉基因美生物科技有限公司产品。

1.2方法

1.2.1SNI模型建立及给药 120只SD大鼠分为4组，分别为假手术组(A组)、模型组(B组)、黑骨藤10 mg/kg组(C组)、黑骨藤20 mg/kg组(D组)，每组30只。B、C、D组大鼠均行SNI手术：10%的水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，固定于手术板(俯卧位)。消毒右股后部皮肤，剪刀剪一纵行切口(约1 cm)，暴露并游离坐骨神经。在胫神经和腓总神经分离处用止血钳夹闭(30 s)，造成神经挤压伤。用11-0无损伤缝线，固定于神经外膜作为标记。此时大鼠小腿及足完全瘫痪，展爪反射完全消失，则示造模成功[6]。A组暴露并游离坐骨神经但不夹闭，缝合皮肤。术后C、D组大鼠每天分别给予10、20 mg/kg黑骨藤乙醇提取物灌胃，A、B组均用等体积的生理盐水灌胃，灌胃容积均为20 mL/kg。各组均在术后第7、14、28天取材，每次10只。4组大鼠均用适量青霉素粉剂置伤口内预防感染。

1.2.2SFI测定[7]自制行走箱通道(长42.00 cm、宽14.35 cm)，等长、等宽白纸铺于箱底，通道远端放一鼠笼。将大鼠双后肢蘸取碳素墨水，置于行走箱入口，大鼠在爬行过程中，每侧后肢各留下4～5个足印，选择印迹清晰足印，分别测量正常足(normal,N)及伤侧足(experiment,E)的3个指标：(1)足印长度(print length，PL)，足尖到足跟的最大距离；(2)足趾宽度(toe spread,TS)，第1趾到第5趾的距离；(3)中间足趾宽度(intermediary toe spread,IT)，第2趾到第4趾的距离，结果精确到0.10 mm。将上述数据代入Bain公式，测得SFI(SFI=0为正常，SFI=-100为完全损伤)。SFI计算公式如下：SFI=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS]+13.3[(EIT-NIT)/NIT-8.8]

1.2.3血清制备及指标测量 股总动脉取血，离心(3 000 r/min，10 min) 取血清，分装，置-20 ℃冰箱保存备用。ELISA检测IL-1、IL-6、TNF-α水平，均严格按说明书操作。

1.2.4大鼠坐骨神经形态学观察 股总动脉取血后解剖大鼠，取无损伤缝线标记处远侧端坐骨神经(约0.60 cm)，4%甲醛溶液固定备用。常规石蜡包埋，切片(4 μm)，苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察，拍照记录。

2 结 果

2.1各组大鼠坐骨神经病理形态学比较 A组：术后第7天神经纤维组织结构基本正常，大部分轴索大小形态正常排列规则，个别轻度肿胀；大部分髓鞘结构清楚，个别轻度变性；施万细胞形态数量分布正常；神经束膜个别炎细胞浸润。第14、28天神经纤维组织结构基本正常，轴索大小形态正常排列规则，髓鞘结构清楚，施万细胞形态数量分布正常。B组：术后第7天神经纤维轻度排列紊乱，中度轴索肿胀，轻度髓鞘变性，施万细胞中度减少，神经束膜轻度炎症细胞浸润。第14、28天神经纤维重度排列紊乱，重度轴索肿胀及脱失，重度髓鞘变性及脱失，施万细胞重度减少，神经束膜轻度炎症细胞浸润；且在第28天时有中度纤维组织增生。C、D组：术后第7天时神经纤维轻度排列紊乱，轻度轴索肿胀，轻度髓鞘变性，施万细胞轻度减少，神经束膜轻度炎症细胞浸润。第14天时C、D组大鼠神经纤维轻度排列紊乱，C组大鼠中度轴索肿胀、中度髓鞘变性、施万细胞中度减少，D组大鼠轻度轴索肿胀、轻度髓鞘变性、施万细胞轻度减少，两组神经束膜均为轻度炎症细胞浸润。C组第28天时神经纤维轻度排列紊乱，轻度轴索肿胀及脱失，轻度髓鞘变性及脱失，施万细胞轻度减少，神经束膜轻度炎症细胞浸润，轻度纤维组织增生；D组第28天神经纤维组织结构基本正常，大部分轴索大小形态正常排列规则，个别轻度肿胀；大部分髓鞘结构清楚，个别轻度变性；施万细胞形态数量分布正常；神经束膜个别炎症细胞浸润，见图1。

图1各组大鼠术后各时间点坐骨神经的病理组织学检查(HE，×200)

2.2各组大鼠术后各时间点SFI比较 与A组比较，B组各时间点SFI明显降低(P<0.01)，证实模型复制成功。C、D组SFI与同时间点B组比较升高，但术后7 d差异无统计学意义(P>0.05)；C组术后28 d明显升高(P<0.01)，D组术后14、28 d出现明显增高(P<0.01)，见表1。

表1 各组大鼠SFI比较

a：P<0.01，与A组比较；b：P<0.01，与B组比较

2.3各组大鼠术后各时间点血清IL-1水平比较 与A组比较，B组术后7、14、28 d血清IL-1水平明显升高(P<0.01)；与B组比较，D组血清IL-1水平明显降低(P<0.05)，C组血清IL-1水平有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.4各组大鼠术后各时间点血清IL-6水平比较 与A组比较，B组术后7、14、28 d血清IL-6水平明显升高(P<0.01)；与B组比较，D组大鼠血清IL-6水平明显降低(P<0.05)，C组大鼠IL-6有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.5各组大鼠术后各时间点血清TNF-α水平比较 与A组比较，B组术后7、14、28 d血清TNF-α水平明显升高(P<0.01)；与B组比较，D组大鼠术后7、14、28 d血清TNF-α水平均明显降低(P<0.05)，C组除术后28 d血清TNF-α水平降低差异有统计学意义(P<0.05)外，术后7、14 d的血清TNF-α水平虽有所降低，但差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表2 各组大鼠术后各时间点血清IL-1水平比较

a:P<0.01,与A组比较;b:P<0.05,c:P<0.01,与B组比较

表3 各组大鼠术后各时间点血清IL-6水平比较

a:P<0.01,与A组比较;b:P<0.05,c:P<0.01,与B组比较

表4 各组大鼠术后各时间点血清TNF-α水平比较

a:P<0.01,与A组比较;b:P<0.05,c:P<0.01,与B组比较

3 讨 论

SFI是对神经功能进行量化评价的客观指标[8]。神经损伤对SFI的影响继发于踝关节跖屈，脚趾屈肌和足内在因素的损伤，足迹的特征表现为大鼠印迹长度增加，脚趾展开的减少以及中脚趾展开减少[9]。对SFI的分析已被证明是评估SNI和修复后功能的可靠、可重复、经济且能定量的方法，通过对SFI的测量，可以直接反映SNI后的运动神经功能[10]。本研究结果显示，B组较A组SFI明显降低(P<0.01)，证实了SNI模型建立成功，在本实验剂量下，使用黑骨藤乙醇提取物治疗SNI模型大鼠，可使大鼠的SFI明显增加，且对SFI的提高呈剂量及时间依赖性，说明本实验剂量的黑骨藤乙醇提取物治疗，可以改善SNI模型大鼠的坐骨神经功能，对SNI模型大鼠神经的功能修复有明显的治疗作用。

周围神经纤维断裂后，会出现一系列复杂的病理变化，如断端远侧的轴突，很快发生华勒氏变性而崩解，近侧端发生逆行性退变[11]，是神经功能受损的病理基础。在本实验中，坐骨神经HE染色证实，在本实验时程内黑骨藤乙醇提取物的治疗，能够明显减轻神经纤维的肿胀、减少神经组织炎症细胞的浸润等，帮助神经组织恢复正常的组织形态，且D组较C组效果明显，术后28 d较术后7、14 d效果明显，说明本实验剂量和时程内，黑骨藤乙醇提取物的治疗可以改善受损坐骨神经的形态学损伤，减轻炎性反应程度，是本实验中SNI模型大鼠神经功能改善的病理学基础。

WNT蛋白家族在神经系统发育过程中，对神经轴突再生等起重要调节作用的，在神经病理性疼痛的发病机制中扮演重要角色。激活WNT信号通路能够刺激促炎因子TNF-α和IL-1的产生，加重神经病理性疼痛的进展[12]。PNJ后，伤害性刺激从外周传入中枢，胶质细胞上相关分子模式感知这些信息后，会引起胶质细胞激活，并使炎症细胞浸润释放促炎性细胞因子，如IL-1、IL-6、TNF-α等，导致坐骨神经发生炎性反应[13-14]，神经炎性反应使传递痛觉的神经元兴奋，促进中枢敏化形成，在行为上则表现为痛觉等现象[15]。神经炎性反应在神经病理性疼痛的形成中起着关键作用，减轻神经炎性可以减轻疼痛保护改善神经损伤[12]。本实验结果显示，与B组比较，C组在术后28 d TNF-α水平明显降低，D组术后7 d IL-1、IL-6、TNF-α水平均明显降低(P<0.05)。证实了黑骨藤乙醇提取物的治疗可减轻SNI模型大鼠神经炎症从而减轻神经疼痛，改善损伤的神经功能。

传统医药中，黑骨藤主要用于跌打损伤、风湿等痛证。本研究以近年来免疫炎症理论在PNJ中的应用为前提，结合课题组前期研究工作，建立坐骨神经钳夹伤模型，证实黑骨藤对SNI有一定保护作用，并且其药效与剂量、时间有关，其作用机制可能与抑制免疫炎症因子分泌有关。