miRNA-141对胃癌细胞增殖及侵袭的抑制作用*

张 诚，周 超

(上海交通大学医学院附属仁济医院胃肠外科，上海 200127)

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，尤其是农村发病率极高其病死率较高，特别是在发展中国家，我国胃癌死亡病例数占全世界约40%。虽然近年来随着医学影像技术手段发展，胃癌的治愈率有所提高，但是早期诊断率仍极低，不及20%，使得众多患者一确诊基本处于中晚期，预后极差[1]。因此进一步的探寻胃癌早期诊断标记物对于胃癌的治疗及预后将具有重大意义。miRNA是一类长度为21～23 nt的在真核生物钟高度保守的非编码RNA小分子，能与靶基因的3′非翻译区特异性结合，在转录水平上调控靶基因表达，进而参与细胞的生命过程。miRNA与肿瘤的发生、发展密切相关，近年来引起了众多学者的兴趣，miRNA-200家族就是一种[2-4]。miRNA-200家族包括5个成员(miRNA-200a，miRNA-200b，miRNA-200c，miRNA-141，miRNA-429)，研究显示此家族成员在不同的肿瘤组织，不同的亚细胞中表达趋势不一致，在众多肿瘤组织中高表达，而在少数的肿瘤组织或细胞中低表达[5]。不过目前已有研究报道证实miRNA-200家族成员在胃癌组织中低表达[6-7]，但在胃癌的发生、发展的具体作用机制尚不清楚，因此本研究以miRNA-200家族成员之一的miRNA-141为研究对象，探讨miRNA-141在胃癌细胞增殖、侵袭中的作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株 人胃癌细胞NCI-N87、SGC-7901、MGC-803、MKN-45、HGC-27、BGC-823及正常人胃黏膜上皮细胞株GES-1购于中国科学院上海细胞库。

1.1.2主要试剂和仪器 胎牛血清，DMEM培养基购于美国Hyclone公司；Trizol总RNA提取试剂盒、LipofectamineTM3000脂质体、反转录试剂盒(第一链cDNA合成试剂盒)购于大连宝生生物技术有限公司；miRNA-141 mimics和miRNA-141 NC购于广州锐博技术有限公司；二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)流式双染试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；Transwell小室购于美国Corning公司；兔抗人增殖细胞核抗原(PCNA)、c-myc、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)多克隆抗体购于美国Abcam公司。MK3酶标仪购自美国thermo公司；Stepone plus 荧光定量PCR购自美国ABI公司；FACSCalibur型流式细胞仪；AF6000型荧光显微镜购于德国莱卡公司；GelDoc XR System凝胶成像系统购于伯乐生命科学产品上海有限公司。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测miRNA-141的表达 微量紫外分光光度计检测RNA纯度，当检测出的RNA纯度(OD260nm/OD280nm=1.8)良好时候，根据反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，基于 SYBR Green I 荧光分析的反转录PCR(RT-PCR)分析，最后根据2-△△Ct法分析miRNA-141水平。miRNA-141上游引物：5′-GGU AGA AAU GGU CUG UCA CAA U-3′，下游引物：5′-AAU GCC UAA CAU GCA GUC GAU G-3′，GAPDH上游引物：5′-AGC CAC ATC GCT CAG ACA-3′，下游引物：5′-TGG ACT CCA CGA CGT ACT-3′。

1.2.2miRNA-141 mimics和miRNA-141 NC的转染 当胃癌细胞生长程度达到50%左右时候，将用Opti-MEM稀释好的LipofectamineTM3000与 miRNA-141 mimics和miRNA-141 NC混匀，加入到细胞中，6 h将细胞培养板中的液体吸走弃掉，换成含10%胎牛血清的培养基，继续培养48 h，利用RT-PCR法检测转染效果。

1.2.3甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力 将胃癌细胞接种到96孔板，细胞贴壁后，按“1.2.2”转染48 h后，加入MTT孵育4 h后，每个96孔板细胞中加入150 μL二甲基亚砜，并将96板置于微量振荡器上使结晶物溶解，于酶标仪波长560 nm处测OD值。

1.2.4Annexin V-FITC/PI流式细胞法检测细胞凋亡 将胃癌细胞接种到6孔板，细胞贴壁后，按“1.2.2”转染48 h后，收集细胞，并按照Annexin V-FITC/PI流式细胞说明书操作按顺序加入结合缓冲液、Annexin V-FITC及PI染液，最后在流式细胞仪上进行细胞凋亡分析。

1.2.5Transwell法检测细胞侵袭能力 Transwell小室平铺Matrigel胶，Transwell下室加入含10%胎牛血清的培养基。将按“1.2.2”转染48 h后的胃癌细胞制成单细胞悬液接种到Transwell上室，继续培养48 h后，将小室取出来，用棉签擦去Transwell上室细胞，用多聚甲醛固定Transwell下室细胞，结晶紫染色，在倒置显微镜下观察细胞侵袭情况并计数。

1.2.6Western blot检测细胞中MMP-2、MMP-9表达 将胃癌细胞接种到6孔板，细胞贴壁后，按“1.2.2”转染48 h后，在4 ℃条件下收集、裂解细胞，并得到细胞中的总蛋白。BCA试剂盒测定总蛋白浓度，取30 g样品上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳1～2 h，转聚偏氟乙烯(PVDF)膜30～50 min。2%的BSA室温下孵育1 h，一抗溶液(兔抗人PCNA、c-myc、MMP-2、MMP-9、PI3K、AKT、p-AKT多克隆抗体)4 ℃过夜孵育，第二天在室温下孵育二抗，最后根据化学发光免疫试剂盒说明书在凝胶成像系统中曝光各蛋白条带，并分析条带灰度值。

2 结 果

2.1各组细胞株中miRNA-141表达水平比较 miRNA-141在胃癌细胞NCI-N87、SGC-7901、MGC-803、MKN-45、HGC-27、BGC-823中的表达水平(2.05±0.20、1.76±0.17、1.04±0.10、1.23±0.12、0.89±0.09、0.45±0.04)明显低于正常人胃黏膜上皮细胞GES-1(2.87±0.30)表达水平(P<0.01)，其中在BGC-823表达水平最低，且差异具有统计学意义(P<0.01)，见图1。

2.2miRNA-141 mimics组和miRNA-141 NC组miRNA-141表达水平比较 miRNA-141 mimics组、miRNA-141 NC组miRNA-141相对表达水平分别为2.38±0.21、0.39±0.04，miRNA-141 mimics组中miRNA-141表达水平较miRNA-141 NC组明显上调 (P<0.01)。

a：P<0.01，与GES-1比较

图1 miRNA-141在各组细胞中的表达水平比较

2.3miRNA-141 mimics对BGC-823细胞活力及凋亡情况的影响 miRNA-141 mimics组细胞活力较miRNA-141 NC组明显降低(P<0.01)。miRNA-141 mimics组细胞早期与晚期凋亡率较miR-141 NC组(0.68±0.07)明显提高(P<0.01)，见表1。

2.4miRNA-141 mimics对BGC-823细胞侵袭能力的影响 miRNA-141 mimics组、miRNA-141 NC组细胞侵袭数目分别为(43.79±4.38)、(178.44±17.50)个，miRNA-141 mimics组细胞侵袭数目较miRNA-141 NC组明显降低(P<0.01)，见图2。

表1 miRNA-141 mimics对BGC-823细胞活力及凋亡的影响

a：P<0.01，与miRNA-141 NC组比较

A：miRNA-141 NC组；B：miRNA-141 mimics组

图2倒置显微镜下两组BGC-823细胞侵袭能力显像(×200)

2.5两组BGC-823细胞中PCNA、c-myc等表达水平比较 miRNA-141 mimics组中PCNA、c-myc、MMP-2、MMP-9、PI3K、p-AKT表达水平较miRNA-141 NC组明显下调，差异均有统计学意义 (P<0.01)，见图3。

A：miRNA-141 NC组；B：miRNA-141 mimics组；a：P<0.01，与miRNA-141 NC组比较

图3两组BGC-823细胞中PCNA、c-myc等表达水平比较

3 讨 论

miRNA-200家族是近年的热点研究miRNA，此家族包括5个成员，分为两个亚族，不同亚族之间既具有相同的功能，也具有特殊性。其中miRNA-141位于人12号染色体，在肝癌、肺癌、结直肠癌及胰腺癌等肿瘤中表达失调，并与肿瘤的发生、发展密切相关[8]。同时GOMES等[9]通过采用自组织映射图(self-organizing maps)鉴定出胃癌组织中的miRNA表达谱，miRNA-141就是其中一种失调的miRNA。后来LU等[10]研究证实miRNA-141在胃癌组织中低表达，并与肿瘤分化、TNM分期、淋巴结转移及远处转移正相关。ZHANG等[11]研究利用miRNA微阵列证实包括miRNA-141在内的5个miRNA在胃癌血浆中低表达。而且ZHOU等[12]研究证实miRNA-141不仅在胃癌组织中低表达，当miRNA-141过表达后能够与MEG3相互作用或者靶向调控E2F3表达进而参与胃癌的发生。充分说明miRNA-141与胃癌的发生、发展密切相关，但是miRNA-141对胃癌细胞的增殖及侵袭的影响还少见报道，所以本研究将对此展开探讨。本研究首先利用RT-PCR法检测胃癌细胞NCI-N87、SGC-7901、MGC-803、MKN-45、HGC-27、BGC-823及正常人胃黏膜上皮细胞株GES-1中miRNA-141表达，结果表明胃癌细胞中的miRNA-141表达低于GES-1细胞，与miRNA-141在胃癌组织及癌旁组织中的表达趋势一致[9-12]。接着利用脂质体将miRNA-141 mimics及miRNA-141 NC转染到BGC-823细胞中，RT-PCR法证实转染成功。而且MTT法及Annexin V-FITC/PI流式双染结果表明miRNA-141 mimics能明显地降低BGC-823细胞活力，提高细胞早期及晚期凋亡率，与miRNA-141在其他肿瘤细胞中的作用效果一致[13-14]。另外本研究还利用Transwell法检测miRNA-141 mimics对BGC-823细胞侵袭能力的影响，结果表明miRNA-141 mimics能明显地抑制细胞的侵袭能力。从而说明miRNA-141 mimics能明显抑制BGC-823细胞活力及侵袭能力，同时诱导细胞凋亡。

肿瘤细胞的无限增殖受多种蛋白的调控，PCNA就是其中一种。PCNA是从系统性红斑狼疮中发现的与DNA的复制密切相关的一种核蛋白质，能推动细胞的增殖。另外癌基因及抑癌基因在细胞的增殖与凋亡中亦起着重要的调控作用。C-myc被认为是癌基因，能促进细胞分裂，使细胞获得无限增殖的可能。MMPs蛋白水解酶所介导的细胞外基质的降解是肿瘤细胞迁移、侵袭、转移的必经过程之一。MMP-2不仅能够通过降解细胞外基质成分促进癌细胞扩散，还能够通过诱导血管新生进一步的促进肿瘤细胞扩散浸润。MMP-9是分子量最大的MMP，能够降解包括Ⅳ在内的几乎所有的细胞外基质成分。因此本研究继续利用Western blot检测miRNA-141 mimics对BGC-823细胞中PCNA、c-myc、MMP-2及MMP-9表达的影响，结果表明miRNA-141 mimics能明显下调PCNA、c-myc、MMP-2及MMP-9表达，继而抑制细胞的增殖与侵袭。

PI3K/AKT信号通路又被称为抗凋亡信号通路，在众多肿瘤组织中被高度激活。当PI3K受到上游信号刺激后，能使磷脂酰二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)的3′羟基磷酸化，转化为三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，进而使AKT结构发生变化并在丝氨酸/苏氨酸位点磷酸化，p-AKT进一步的调控下游靶蛋白(Bcl-2、MMPs)的表达，参与细胞的增殖、凋亡、侵袭等生物学行为。而且有研究证实PI3K/AKT信号通路拮抗剂PH域富含亮氨酸重复蛋白磷酸酶(PHLPP)1及PHLPP2 能扭转miRNA-141在非小细胞肺癌细胞中的作用[15]，提示miRNA-141与PI3K/AKT信号通路之间具有明显相关性。所以本研究继续利用Western blot检测miRNA-141 mimics对BGC-823细胞中PI3K/AKT信号中相关蛋白表达的影响，结果表明miRNA-141 mimics能明显的下调PI3K及p-AKT表达。

综上所述，miRNA-141在胃癌细胞NCI-N87、SGC-7901、MGC-803、MKN-45、HGC-27、BGC-823中的表达水平低于正常人胃黏膜上皮细胞株GES-1中表达水平，提高BGC-823细胞中miRNA-141表达水平，能明显降低细胞活力，提高细胞凋亡率，抑制细胞侵袭，并下调PCNA、c-myc、MMP-2及MMP-9表达，可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。