兔p38MAPK基因沉默腺病毒载体构建及体外干扰效率的鉴定*

全 钢，贾铠宁，于 果，许尧祥，岳 金，肖文林△

(1.新疆生产建设兵团第四师医院口腔颌面外科，新疆伊宁 835000； 2.青岛大学附属医院口腔科/青岛大学口腔医学院/青岛大学附属医院山东省教育厅口腔重点实验室，山东青岛 266555)

尽管唇裂修复术手术缝线不断更新、术式不断改良，但是唇裂术后瘢痕甚至瘢痕的增生不仅影响患者面部的美观，甚至对患者的心理造成不良影响。基因治疗用于改善伤口修复方面是一个新的概念，其为从根本上防治瘢痕的增生性病变提供了可能。如果不针对特定的因子突变位点进行基因敲除，可能引起皮肤正常发育紊乱甚至动物死亡。因此，研究伤口愈合的理想模型是于局部伤口中应用基因转导使某种基因敲除或过表达，来观察其对伤口修复机制的影响。鉴于以往的实验研究结果可知，腺病毒是针对皮肤瘢痕进行基因治疗的理想载体。本实验的目的是构建p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)基因沉默病毒载体，为唇裂术后瘢痕增生的基因治疗提供理论支持。

表1 p38MAPK的shRNA序列

F:正向；R:反向

1 材料与方法

1.1材料 (1)动物：新西兰兔64只，购自青岛康大生物科技有限公司。(2)仪器与试剂：冷冻高速离心机购自美国Thermo fisher公司，DNA电泳系统、凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司，M199液体培养基购自美国Sigma公司，T4 DNA Ligase、Pst Ⅰ、BamH Ⅰ购自美国NEB公司，胎牛血清(Gibco)、HEK293A细胞株购自中国科学院上海细胞库，DH5a感受态细胞、小量质粒抽提试剂盒、Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker购自北京全式金生物公司，DNA测序购自上海生工生物公司，腺病毒干扰载体质粒购自北京欧林格生物公司， shRNA片段合成购自南京金斯瑞生物公司，Qiagen大规模质粒抽提试剂盒购自德国Qiagen公司，pDC316-ZsGreen-ShRNA腺病毒试剂盒购自美国Biovector公司。

1.2方法

1.2.1pDC316-ZsGreen-ShRNA重组质粒的构建 利用p38MAPK序列cDNA文库设计shRNA序列，经Blast表明其与小鼠其它cDNA序列不同源，合成3条含干扰序列的双链DNA oligo。根据p38MAPK序列设计shRNA，合成3个shRNA片段，合成序列见表1。DNA片段经由退火缓冲液完全退火后，3对片段分别用T4连接酶将其与pDC316-shRNA-ZsGreen连接起来。将10 μL过夜连接产物转化100 μL感受态细胞，涂于含氨苄西林的LB培养基上，37 ℃恒温培养箱培养过夜。在5 mL，100 μg/mL Ampicillin抗性的LB培养液中分别挑取1个单菌落接种培养，250 r/min，37 ℃恒温摇床培养过夜。随后抽提质粒，分别用BamHⅠ和EcoRⅠ做酶切鉴定。构建的3组重组质粒分别命名为pDC316-ZsGreen-ShRNA-1、2、3。

1.2.2AD-shRNA-p38MAPK腺病毒病毒包装 将HEK293A细胞种在面积为10 cm2培养皿中，传代培养。使用血球计数板计数，调整细胞密度后重新接种于6孔板中。用500 μL无血清稀释培养基对4 μg pDC316-ZsGreen-ShRNA重组质粒、10 μg Pshutter-CMV、10 μg pAdenoviral vector稀释，充分混匀。加入30 μL Lipofectamine3000脂质体共转染，室温静置20 min。将转染复合物逐滴加入HEK293A细胞培养皿中。第2天利用完全培养基对去除含DNA-脂质体复合物进行培养，48～72 h可产生大量病毒。对病毒进行收集，使用0.45 μm滤器进行过滤4 ℃、10 000 r/min超速离心2 h后弃上清液，沉淀物为p38MAPK基因RNAi腺病毒载体将沉淀下的载体分装后，保存于-80 ℃冰箱。将腺病毒载体分为3组，分别为AD-shRNA-p38MAPK-1、AD-shRNA-p38MAPK-2、AD-shRNA-p38MAPK-3。将纯化的病毒倍比稀释后转染HEK293A细胞，48 h荧光显微镜观察荧光；稀释病毒上清液的体积均为107μL。将HEK293A细胞放于12孔培养板中，混匀后培养于37 ℃ CO2孵箱。24 h后添加100 μL完全培养基。4 d后观察荧光表达情况。随着稀释倍数的增加，荧光细胞数减少。换算公式：滴度(TU/mL)=荧光细胞个数/病毒原液量

1.2.3分离培养兔皮肤成纤维细胞 用水合氯醛将新西兰兔麻醉后俯卧位固定，乙醇棉球消毒脱毛区后切取约2 cm×3 cm的皮肤。放于250 U/mL双抗生理盐水中浸泡灭菌30 min，而后刮去皮下脂肪等。用PBS洗涤数遍，剪成约1 mm3左右的皮片。常温下用混合酶消化45 min，持续振荡。细胞沉淀重悬后接种培养。弃培养基，先用PBS洗1遍，而后加入1～2 mL胰酶，消化。1 000 r/min离心3 min，弃上清液，加入完全培养基培养传代。

1.2.4实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测腺病毒感染皮肤成纤维细胞后p38MAPK的干扰效率 调整细胞密度而后重新接种于6孔板中，培养过夜，细胞贴壁后感染。感染前2 h换液。按照每孔感染复数(MOI)=1∶5比例加入病毒。感染48 h后，参照说明书进行反转录PCR(RT-PCR)检测。每一标本分别放入3个复孔中，得出每组的Ct值，从而计算出每组的相对表达水平。所有实验重复3次。RT-PCR检测的目的基因引物序列的正义链：5′-GGG ACC TAA AGC CTA GTA AC-3′；反义链：5′-CGA CCG ACC AAA TAT CAA-3′。内参β-actin引物序列正义链：5′-TGG CTC TAA CAA GTC CGC CTA G-3′；反义链：5′-AGT GCG ACG TGG ACA TCC G-3′。

2 结 果

2.1重组质粒的酶切鉴定及测序结果 将重组质粒分别以BamHⅠ和EcoRⅠ做酶切鉴定，鉴定酶切图谱见图1。挑取酶切鉴定正确的阳性菌测序，测序峰图见图2。酶切鉴定结果及测序结果说明，3个pDC316-shRNA-ZsGreen质粒均完全符合设计要求。

M：Marker;1、2、3：构建的质粒；4：空白对照组

图1重组质粒PCR酶切鉴定图

2.2转染后HEK293A的细胞效应 pDC316-ZsGreen-shRNA-p38MAPK-1、pDC316-ZsGreen-shRNA-p38MAPK-2、pDC316-ZsGreen-shRNA-p38MAPK-3载体分别共转染HEK293A细胞后，HEK293A细胞变圆，部分融合，出现多核复合体，见图3。

2.3兔皮肤成纤维细胞分离培养 显微镜下，原代兔上唇皮肤成纤维细胞，大致呈梭形或纺锤形，见图4。

2.4real-time PCR检测腺病毒感染目的细胞后p38MAPK的干扰效率 校准基因为管家基因β-actin作为空白对照组，兔上唇成纤维细胞p38MAPK mRNA的相对表达水平定为1；所有标本重复3次，计算-△△ct，以平均相对表达水平为2-△△Ct计算其他各病毒转染组兔上唇成纤维细胞p38MAPK 的 mRNA的相对表达水平。与空白对照组比较，各组p38MAPK mRNA相对表达水平均有不同降低，其中AD-shRNA-p38MAPK-1组的p38MAPK的mRNA表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5。

1、2、3：重组质粒pDC316-ZsGreen-shRNA-p38MAPK-1、2、3；4：重组质粒NC组

图2 p38MAPK干扰序列测序结果图

图3 pDC316-ZsGreen-shRNA-p38MAPK转染后293T细胞出现细胞病理效应(×200)

图4 培养的兔上唇成纤维细胞(×400)

1:AD-shRNA-p38MAPK-1组；2:AD-shRNA-p38MAPK-2组；3:AD-shRNA-p38MAPK-3组；4:pDC316-ZsGreen-shRNA-scramble组；5:空白对照组；a:P<0.05，与AD-shRNA-p38MAPK比较

图5 p38MAPK腺病毒转染后的各组细胞mRNA相对表达水平

3 讨 论

伤口的愈合分为两种：一种是由与受损伤部位特性相同的细胞修复即完全性修复，常见于表浅伤口的正常愈合及胎儿伤口无瘢痕愈合；另一种是几乎所有伤口愈合的结局，即上皮化的同时瘢痕形成。伤口收缩是加速伤口愈合的关键环节，但是过度的收缩则会导致伤口挛缩的发生，严重影响机体的功能和美观。但目前尚未发现可以抑制瘢痕形成的方法。

MAPKs是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内，p38MAPK是其一个亚家族，是MAPK信号传导通路一种经典途径[1-2]。其参与调控细胞生长、发育、分裂，并在伤口愈合中发挥作用。有研究表明，瘢痕成纤维细胞的分化依赖于α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1(TGF-β1)及机械力的参与[3]。陈伟等[4]研究发现MKK3、MKK6和p38MAPK基因表达在早期妊娠胎儿的皮肤组织中表达较强。随着胎龄的增加，其表达逐渐减弱，其基因表达的变化与伤口愈合形成瘢痕的过程相一致。从而发现MKK3、MKK6和p38MAPK基因高表达可能是早期妊娠胎儿皮肤伤口无瘢痕愈合的原因。杜启翠等[5]的研究表明，p38MAPK阻断剂可以减少成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，减少α-SMA和TGF-β1的表达，从而可以防止皮肤瘢痕的形成。这些研究均表明在伤口的愈合中p38MAPK信号通路可能起着举足轻重的作用，同时其之间的关系还有待进一步的研究。

基因治疗是指将外源正常基因导入受体细胞，以纠正或补偿基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗疾病的目的，可基因治疗最初被认为只是一种治疗先天性代谢功能缺陷或晚期恶性肿瘤患者的方式[6]。基因可通过体内或体外的方法进行转导。载体的选择对于基因的转导十分关键[7-9]。目前,基因治疗中基因转导方式有两种，分别是病毒基因转导和非病毒基因转导。病毒的基因转染的效率明显偏高。病毒介导基因转染的创伤基因治疗的理想模型具有高效性、自限性、靶向性、少或无毒副作用及特异性。腺病毒、反转录病毒、慢病毒为最常用的病毒载体。腺病毒是目前瞬时基因转导最有效的载体，因其广泛的细胞趋向性，可以作为不同组织的良好指示剂。反转录病毒载体具有能够整合入宿主细胞基因组的优点，因此具有实现缺陷基因的终生校正的潜力。使用反转录病毒载体的主要缺点是转导效率低，因为载体需要转染分裂细胞，并且在体内不稳定[10]。研究已表明皮肤细胞转染效率高达95%，皮肤转染模型安全性较高。因此，人类腺病毒是基因治疗中最常见的病毒载体。STITELMAN等[11]的研究表明，腺病毒介导的血小板源性生长因子β(PDGF-β)的基因转移克服了伤口愈合中的缺血缺陷，并对于治疗慢性非愈合性伤口提供了希望，其病毒的衣壳蛋白作用可能是腺病毒引起急性炎性反应的原因。皮肤是腺病毒介导的基因治疗的理想靶器官[12-13]。ARAGONA等[14]的研究表明,在小鼠皮肤上腺病毒介导的转染基因可高效表达。免疫反应导致的炎症是腺病毒载体转导中对伤口愈合最大的影响，而SYLVESTER等[15]的文献表明，尽管腺病毒转导后的小鼠模型皮肤伤口出可能引发急性炎性反应,但并未最终影响受伤皮肤的愈合能力。

成纤维细胞是皮肤疏松结缔组织中的重要细胞，也是瘢痕形成过程中的重要细胞。瘢痕是在伤口愈合过程中，肌成纤维细胞形成，从而使创口收缩而形成的。现在已有成熟的成纤维细胞和角质形成细胞的细胞培养技术，基因检测技术更加成熟[16]。

本实验取新西兰白兔上唇皮肤，成功培养出成纤维细胞，将构建的病毒载体可以成功转染到皮肤成纤维细胞中，并运用此细胞筛选出沉默效率最高的一个腺病毒载体，为其能在活体局部注射后取得良好的沉默效果奠定了基础。