云南德宏水牛和杂交牛（摩拉水牛×德宏水牛）血清中两种同工酶的多态性研究

王婷，杨仁丹，张永云，孙政，杨忠，李卫真

( 1.云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201; 2.云南农业大学动物医学院，昆明 650201;3.云南农业大学农科专业基础实验教学示范中心，昆明 650201;4.云南生物制药有限公司，昆明 650503）

水牛奶被称为天然的“最接近完善的食物”，其乳脂含量、乳蛋白含量均明显高于荷斯坦牛奶[1]。其平均乳蛋白含量为4.5%，是荷斯坦牛的1.32倍，乳脂率平均为7.5%，相当于荷斯坦牛的两倍多[2]。且水牛奶易于吸收，各种氨基酸、维生素、矿物质微量元素齐全，比例均衡，是人类理想的饮用乳品[3]。水牛奶脂肪球和酪蛋白胶粒大，风味浓郁、口感饱满，是生产乳制品的最佳原料[4]。由于水牛奶的优异特性，其生产前景广阔，是一种优质乳品[5]。德宏水牛是云南省优良的地方品种，具有体型大、耐粗饲及抗病力、抗逆性和役用能力强等优点。应用摩拉水牛种公牛与德宏水牛进行杂交改良，培育乳用型水牛，其产乳性能已经得到了较大提高[6]。

同工酶是指生物体内催化相同的化学反应而酶蛋白的分子结构、理化性质和免疫学性质不同的一组酶。同工酶是由染色体上不同的基因座位编码的生化表型，能较好地反映物种间的遗传差异[7]。乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）同工酶是一种结合蛋白质，以NAD+为辅酶，催化乳酸脱氢变成丙酮酸，是糖类代谢中所必需的酶[8]。LDH普遍存在于哺乳动物的组织和体液中，由M型和H型两种亚基根据不同的排列组合构成五种不同形式的四聚体[9]。代谢物和遗传基因对LDH的生成有双重控制的作用，因而LDH在电泳酶谱上出现种属特异性和组织特异性。过氧化物酶（peroxidase，POD）同工酶是一族能利用H2O2氧化供氢体的酶，对H2O2的需求非常专一，而对供氢体的要求则比较广泛[10]。酚类和胺类化合物、某些杂环化合物及一些无机离子等都可以作为过氧化物酶的供氢体，其主要功能是清除氨基酸分解代谢及糖醛酸合成代谢等过程中形成的过氧化物[11]。

目前，对于德宏水牛的研究主要集中在杂交改良提高产奶量方面，对血清同工酶的研究未见报道。本试验对德宏水牛和杂交牛血清中两种同工酶的多态性和LDH含量进行研究，结果可为德宏水牛机体免疫、代谢以及饲养管理、乳制品开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选取云南省德宏州梁河县健康的德宏母水牛28头，芒市健康的摩拉水牛×德宏水牛的杂交母水牛76头。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集和处理

于水牛颈静脉采血5mL，4 000r/min离心15min分离血清，-20℃冷冻保存。试验前将血清样品和40%的蔗糖（含少许溴酚蓝）按1∶1混合。

1.2.2 乳酸脱氢酶分析方法

采用PAGE电泳法，对LDH进行分离[12]。制备7.5%的分离胶和3%的浓缩胶，每个样品槽上样量为20μL，150V电压电泳6h。电泳结束后，取出凝胶，加入染色液，染色至大多数条带显现蓝紫色时去除染色液，显色时间一般为15～30min。加入脱色液终止酶促反应，并使凝胶底色脱去至清亮[12]。电泳图谱经GelDocTM.XR凝胶成像系统照相和扫描，记录并分析LDH各组分百分比例。

1.2.3 过氧化物酶分析方法

采用PAGE电泳法，对POD进行分离[12]。制备7.5%的分离胶和3%的浓缩胶。每个样品槽上样量为25μL，200V电压电泳5h。电泳结束后，采用醋酸联苯胺法染色[13]，将取出的凝胶侵入染色液中5～10min，取出凝胶用水漂洗，即停止染色。用GelDocTM.XR凝胶成像系统照相、固定保存。

2 结果与分析

2.1 乳酸脱氢酶多态性分析结果

经电泳分析LDH酶谱，按照各成分泳动的快慢，将出现的5条区带从正极到负极划分为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5（图1）。在染色过程中最先出现的是LDH1，且颜色最深，表明它的活性最强，其次是LDH2。由图1可见，德宏水牛和杂交牛血清LDH谱带，归纳起来共有3种多态型，即3种基因型。Ⅰ型由LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5五种酶组成；Ⅱ型由LDH1、LDH2、LDH3、LDH5四种酶组成；Ⅲ型由LDH1、LDH2、LDH5三种酶组成。德宏水牛有Ⅰ、Ⅱ两种基因型，其中以Ⅰ型占优势；杂交牛有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三种基因型，其中以Ⅰ型占优势，其次是Ⅱ型（表1）。

图1 乳酸脱氢酶电泳图谱

表1 德宏水牛和杂交牛血清乳酸脱氢酶基因型频率及组分

用GelDocTM.XR凝胶成像系统对LDH电泳胶进行扫描，结果表明德宏水牛和杂交牛LDH中各成分比例都呈现LDH1＞LDH2＞LDH3＞LDH4＞LDH5的现象（见表2）。其中德宏水牛和杂交牛LDH1百分比分别为47.25%±1.62%和49.27%±0.84%，在LDH同工酶组分中占优势。德宏水牛LDH3占14.07%±0.49%，显著高于杂交牛（P＜0.05）。LDH1、LDH2、LDH4、LDH5在德宏水牛和杂交牛中差异性不显著（P＞0.05）。

2.2 过氧化物酶多态性分析结果

由图2可见，将德宏水牛和杂交牛POD划分为两个区，即一区、二区。根据POD的谱带，将其分为5种多态型，即5种基因型。按照各成分泳动的快慢，将一区的条带从负极到正极分为a、b、c三种条带；二区则分为是否存在条带。在这5种多态型中，Ⅰ型由一区a、c和二区条带组成；Ⅱ型由一区a、b、c条带组成；Ⅲ型由一区a和二区条带组成；Ⅳ型由一区a、b、c和二区条带组成；Ⅴ型由一区a、c条带组成。各种多态型出现频率如表3，在28个德宏水牛个体中有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四种多态型，其中Ⅲ型出现频率最高，为42.86%，频率出现最低的是Ⅳ型；在78个杂交牛水牛个体中有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ五种多态型，其中Ⅲ型出现频率最高，为52.63%，频率出现最低的是Ⅳ型。由此可以看出，不论是纯种牛还是杂交牛均为Ⅲ型出现的频率最高，是主要表现形式，其次是Ⅰ型。由电泳图像可以看出杂交牛的多态性高于纯种牛。

图2 过氧化物酶电泳图谱

表3 德宏水牛和杂交牛血清过氧化物酶基因型频率及组分

3 讨论

LDH催化乳酸脱氢生成丙酮酸及其逆反应，几乎存在于所有组织中，由M型和H型两种不同亚基构成五种四聚体，即LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LD，可用聚丙酰胺凝胶电泳法将其分离为5个区带。根据5条区带不同的组合可将德宏水牛和杂交牛血清LDH归纳为3种多态型，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。德宏水牛和杂交牛LDH以Ⅰ型的居多。根据基因型频率可知，在28个德宏水牛样品两种多态型和76个杂交牛样品三种多态型中Ⅰ型出现频率最高，Ⅱ型次之。LDH的条带虽有部分缺失，但是LDH1、LDH2和LDH5的出现率是100%，而LDH3和LDH4的出现率不是100%，这可能是因为种内存在差异[15]。但是同时表明LDH的多态性，纯种牛和杂交牛之间也存在种间差异，杂交牛的多态性高于纯种牛。由于LDH由遗传基因控制，造成德宏水牛LDH差异的原因可能是杂交方式、遗传因素等。所以可以通过LDH酶谱来研究LDH对遗传特性、疾病发生原因、临床治疗等方面的作用。栾桂龙等研究了水牛LDH与产奶量的关系，得出产奶量和LDH1、LDH2呈正相关，与LDH3呈负相关[16]。本试验对各组分含量进行分析，结果LDH1＞LDH2＞LDH3＞LDH4＞LDH5，但德宏水牛和杂交牛血清中各种LDH多态性与生产性能之间的关系尚需进一步研究。

POD是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用[8]。POD具有能使有毒物质失活、调节氧浓度、脂肪酸氧化等功能，还具有抑制病毒活性、抗金属毒害、缓解机械损伤等作用[17～19]。通过对德宏水牛和杂交牛POD多态性的研究发现，POD共由两部分区带组成，根据区带的不同组合可将德宏水牛的POD分为四种多态型，杂交牛则分为五种多态型，由此可看出杂交水牛多态性高于纯种水牛。POD作为一个由单基因控制的同工酶，在很大程度上反映了种、品种间的遗传差异[20]。虽然由一个基因控制，但表现出多态性，除了有遗传因子的控制外，还可能有外在的因素控制。由此可以推断德宏水牛和杂交牛POD同工酶的多态性是由遗传因子和杂交方式共同作用的结果。

表2 德宏水牛和杂交牛血清乳酸脱氢酶相对含量