成年大鼠脊髓损伤模型音猬因子的表达研究

音猬因子是胚胎发育过程中脊索产生的一种神经调控因子，其对神经管腹侧结构的形成、发育与分化有所影响[1]。近年来的研究发现，音猬因子在神经轴突损伤后修复和再生过程中有活跃表现，并且在很多神经性疾病中音猬因子信号也有重要作用，有实验证实音猬因子信号可以对濒死的神经元具有显著的营养和保护作用来延缓神经元坏死等[2-3]。为进一步探讨音猬因子表达和神经损伤以及神经发育的关联性展开本组研究。

1 材料与方法

1.1 材料来源：从实验室饲养大鼠中选取30只符合纳入标准的成年大鼠为研究对象，均为常规环境下饲养的健康大鼠。

1.2 纳入标准：①均为成年健康大鼠，体质量220～250 g。②雌雄不限。

1.3 处理方法：将30只大鼠分为两组，其中5只仅咬除椎板作为空白组，其余25只制作脊髓损伤模型。造模方法：25只大鼠按照标准0.3 mL/100 g腹部注射10%水合氯醛；参考Allen's打击法进行脊髓损伤模型制作，麻醉完成后大鼠取俯卧位并固定四肢，影像学设备辅助下确定大鼠脊髓T10节段，做纵向切口，使皮下组织、筋膜、肌肉、棘突暴露，使用咬骨钳咬除T10节段对应棘突和椎板，并制作圆形骨窗，使脊髓硬膜囊暴露。使用垫片覆盖T10脊髓，从25 mm高度自由落下重10 g克氏针对脊髓进行冲击，形成损伤。观察到对应部位出现充血、水肿且下肢迅速回缩、尾巴翘起、大鼠迅速倒下时则可认定为脊髓损伤模型制作完成。

1.4 行为学评估：分别于模型制作完成后第1、3、5、7、14天时取5只大鼠进行行为学评估。主要观察项目为大鼠脊髓损伤后不同时间点肢体功能恢复情况，以此为依据评估脊髓神经功能恢复情况。采用BBB评分和斜板试验进行行为评估，斜板试验为使大鼠身体轴线和斜板纵轴垂直后不断调整斜板坡度，以大鼠能够在斜板上停留5 s的最大坡度为其肢体功能评分。

1.5 音猬因子检测方法：使用免疫组织化学技术检测音猬因子表达，显微镜下检测脊髓组织免疫组化染色后音猬因子的表达。音猬因子mRNA检测及半定量采用原位杂交技术。利用高清晰彩色病理图像分析系统对音猬因子表达进行图像分析，选取视野内阳性反应细胞并进行半定量分析。根据原位杂交信号强度和分布情况确定4个等级，分别为无信号（-）、低信号（+）、中等信号（++）、高信号（+++）。

1.6 统计学方法：使用SPSS14.0软件对数据进行统计学处理，计量资料平均数±标准差（±s）表示，经t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 行为学评估：脊髓损伤模型下的5只大鼠出现不同程度的后肢力量减弱、行走缓慢、步态异常，与空白组比较存在差异，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 模型制作完成后第1、3、5、7、14天进行行为学评估结果（

表1 模型制作完成后第1、3、5、7、14天进行行为学评估结果（

脊髓损伤组斜板试验评分脊髓损伤第1天 21 1.1±0.2 65.0±4.1 32.1±3.5脊髓损伤第3天 21 2.1±0.3 65.1±3.6 34.3±3.6脊髓损伤第5天 21 2.6±0.4 65.3±3.2 36.2±3.9脊髓损伤第7天 21 3.2±0.5 65.7±3.9 38.8±4.2脊髓损伤第14天 21 6.1±0.7 65.8±3.8 42.9±4.5组别 空白组BBB评分脊髓损伤组BBB评分空白组斜板试验评分

根据表中统计结果可以发现，空白组大鼠BBB评分和斜板试验评分随时间推移整体变化值较小，而脊髓损伤模型大鼠的对应评分则随着时间推移不断改善，这提示随着时间的推移脊髓损伤模型下的成年大鼠脊髓功能逐渐恢复。

2.2 音猬因子表达检测结果：通过免疫组化检查，脊髓损伤模型后第3天观察到音猬因子蛋白开始表达。脊髓损伤模型制作第1天后，取5只成年大鼠进行音猬因子mRNA检测，发现可见音猬因子表达低信号，范围较为局限，仅在脊髓灰质区域内，白质区域内未检测到音猬因子mRNA，表达信号为-。脊髓损伤模型制作第3天后，取5只成年大鼠进行音猬因子mRNA检测，可同时检测到音猬因子表达中等信号和低信号。损伤区内音猬因子表达为中等信号，损伤区远端10 mm处音猬因子表达为低信号。随后在脊髓损伤模型制作后的第7天，音猬因子mRNA表达水平在损伤区远端10 mm处的灰质和白质中表达达到最大值，可见高信号，通过染色后镜下观察，发现在少突胶质细胞中音猬因子表达水平最高，室管膜区域内音猬因子mRNA表达仅存在于损伤区域的5 mm范围内，分布区域较小。而在空白组的5只大鼠中，全时间段均未见到音猬因子mRNA表达。同时在免疫组化检测中，仅少突胶质细胞中存在音猬因子表达，而星形胶质细胞中则未见音猬因子表达。

3 讨 论

根据相关研究报道[4-5]，可以确定音猬因子是脊髓腹侧神经干细胞分化过程中的活跃成分，从某种意义上来说音猬因子决定了胚胎期神经细胞的增殖和分化方向，是神经系统再生的重要元素[6]。

在本组研究中，共准备了30只成年健康大鼠为研究样本，共制作了5只空白组和25只脊髓损伤模型组，同时从行为学评估、免疫组化和音猬因子mRNA检测3个方面对空白组和脊髓损伤模型组进行评价。得到以下结论：①随着时间的推移，音猬因子表达强度由低到高，与大鼠肢体功能恢复周期相吻合。②音猬因子表达的最高信号在损伤区域内远端10 mm和少突胶质细胞中，星形胶质细胞中未见音猬因子表达。③音猬因子表达并非脊髓损伤后立即出现，从出现到达到高信号有一定时间差。

因此综上所述，音猬因子表达和脊髓神经功能再生有密切联系，极有可能与神经再生有关，如果想要完全确认音猬因子和脊髓损伤后神经功能再生的关联性，需要进一步研究，但不可否认脊髓损伤是激活音猬因子表达的重要条件。