血浆hsa_circ_0003998在原发性肝细胞癌诊断和预后评估中的临床价值

杨春梅，乔光磊，宋丽娜，吴伟琪，陈 颖，夏 薇，马俐君*

(1.北华大学，吉林 吉林132013；2.上海交通大学医学院附属同仁医院 肿瘤科，上海200336)

原发性肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，目前在全世界癌症发病率中占第六位，死亡率占第四位，其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是其主要病理类型(占75%-85%)[1]。目前原发性肝癌最有效的治疗方法仍然是手术治疗，但由于早期症状并不明显，大部分患者确诊时已是中晚期，仅有约30%的患者适于根治性切除术[2]，导致生存率低、预后差。血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotien，AFP)是目前早期诊断原发性肝癌的首选肿瘤标志物，但其特异性与敏感性不强限制了其临床价值[3]。因此，寻找更加有效的肿瘤标志物是原发性肝癌早期诊断、早期治疗及改善预后的关键所在。

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类具有稳定闭合环状结构的长链非编码RNA，广泛存在于哺乳动物细胞中，具有结构稳定、表达丰度高和组织特异性表达等特征[4,5]。近年的研究表明，circRNA的主要功能包括miRNA“海绵”[6]、调控亲本基因表达[7]、影响基因转录水平[8]等，并且与多种恶性肿瘤的发生及发展密切相关[9-11]。由于circRNA的特殊结构，可耐受核酸外切酶的降解，比线性RNA更加稳定，并且广泛存在于血液、脑脊液、尿液等体液中[12,13]，因此其可能作为肿瘤标志物对恶性肿瘤的诊断及预后具有重要意义。我们前期研究发现，hsa_circ_0003998显著高表达于有门静脉侵犯的HCC癌组织中，因此，本研究旨在检测hsa_circ_0003998在HCC血浆中的表达水平，探讨其在HCC诊断及预后评估的临床价值。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与研究对象

1.1.1主要试剂

Trizol LS试剂(Invitrogen)，总RNA提取试剂盒(RNeasy Plus Mini Kit，QIAGEN),逆转录试剂盒(TaKaRa)，荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa)。

1.1.2研究对象

本研究收集2015年1月至2016年10月在上海交通大学医学院附属同仁医院诊治的行肝癌切除术且病理诊断为HCC的患者共80例，患者术前均未接受放化疗，收集80例患者术前的空腹静脉血，随访至2018年10月；同时期健康人群和乙型肝炎人群各20例，收集空腹静脉血。本研究经上海市同仁医院医学伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1样本采集

采集研究对象空腹静脉血，EDTA抗凝，4℃，1 600×g 离心10 min；12 000 g离心10 min后分离得到血浆，-80℃保存备用。收集6例HCC癌组织(有/无门静脉侵犯者各3例)，-80℃保存备用。

1.2.2总RNA提取及cDNA合成

每250 μl血浆中加入750 μl Trizol LS试剂，进行裂解，按照试剂盒说明书提取总RNA；剪取100 mg组织，至研磨皿中，倒入液氮，将组织研磨成粉末状，放于EP管中，加入1 ml预冷的Trizol LS试剂，吹打均匀，室温放置5 min，按照试剂盒说明书提取总RNA；使用NanoDrop ND-1000测定RNA浓度，按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。

1.2.3转录组测序(RNA-sequening,RNA-seq)

RNA-seq由上海烈冰信息科技有限公司进行检测，简要步骤如下：分别提取6例HCC癌组织的总RNA，使用RiboMinus真核细胞试剂盒去除核糖体RNA，使用核酸外切酶(Rnase R)去除线性RNA，根据NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep试剂盒使用HiSeq2000(Illumina，美国)进行测序工作。差异表达基因的筛选阈值：|log2FC|>1，且P值小于0.05。

1.2.4实时荧光定量反转录聚合酶链反应(Real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR)

使用LightCycler 480II (Roche)仪器，采用SYBR法进行qRT-PCR检测，检测步骤及反应条件参照试剂盒说明书进行。PCR引物由生工生物工程(上海)合成，hsa_circ_0003998上游引物为5’-CAGGAGGTGGTGAAGGACAT-3’，下游引物为5’-CCTGACTGTGCTTCAAACGA-3’，内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)上游引物为5’-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3’，下游引物为5’-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3’，反应体系为为20 μl，SYBR Premix Ex Taq(2x)10 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA 0.5 μl，ROX 0.5 μl，dH2O 8.1 μl。反应条件为：预变性95℃ 5 min，95℃ 5 s，59℃ 10 s，72℃ 30 s，40循环，通过熔解曲线检测产物的特异性，每个样本设3个复孔，取平均Ct值作为样本最后Ct值，计算2-△△CT值反应hsa_circ_0003998表达水平。

1.2.5统计学分析

采用SPSS13.0进行统计学分析，试验数据以均数±标准差表示，两组之间比较采用独立样本t检验，多组之间比较采用方差分析；采用GraphPad Prism 5软件绘制受试者工作特征曲线(Receiver operator characteristic curve,ROC)，并计算曲线下面积(Area under of ROC curve,AUC)评估血浆hsa_circ_0003998对HCC的诊断价值；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank法进行单因素分析，检验因素包括性别、年龄、乙肝表面抗原(HBsAg)、AFP、肿瘤直径、TNM分期、肿瘤分化程度、微血管侵犯(MVI)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)及hsa_circ_0003998相对表达量，COX回归分析进行多因素分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hsa_circ_0003998在有门静脉侵犯的HCC癌组织中高表达

RNA-seq检测发现，在有/无门静脉侵犯的HCC癌组织中有121个共同表达的circRNA，其中上调表达的有14个，下调表达的有8个，上调表达最明显的为hsa_circ_0003998。

2.2 不同分组血浆中hsa_circ_0003998的表达水平

利用qRT-PCR检测HCC、乙型肝炎和健康人中hsa_circ_0003998表达水平，发现HCC血浆中hsa_circ_0003998表达水平显著高于乙型肝炎组和健康人组，差异均有统计学意义(3.12±1.97 vs 1.43±0.91，P<0.001;3.12±1.97 vs 1.21±1.08，P<0.001)，乙型肝炎组和健康人组hsa_circ_0003998的表达无明显差异(P=0.678)(图1)。

图1 hsa_circ_0003998在原发性肝细胞癌、乙型肝炎及健康人血浆中表达水平

2.3 血浆hsa_circ_0003998表达水平与HCC临床病理特征的相关性

HCC血浆中hsa_circ_0003998的高表达水平与AFP(P=0.012)、肿瘤直径(P=0.007)、TNM分期(P=0.011)及组织分化程度(P=0.015)显著相关，而与患者的年龄、性别、HBsAg、MVI、ALT、AST、γ-GT均无显著相关性(P>0.05)(表1)。

表1 血浆hsa_circ_0003998表达水平与原发性肝细胞癌临床病理特征的关系

2.4 血浆hsa_circ_0003998的诊断价值

为了评估血浆hsa_circ_0003998的诊断价值，绘制了HCC区别于健康人的ROC曲线，AUC为0.848，敏感度为75%，特异度为85%(图2A)；绘制了HCC区别于乙型肝炎的ROC曲线，AUC为0.807，敏感度为70%，特异度为80%(图2B)，表明hsa_circ_0003998具有较好的诊断HCC的临床价值。

图A为原发性肝细胞癌与健康人比较，图B为原发性肝细胞癌与乙型肝炎比较

2.5 血浆hsa_circ_0003998的预后价值

根据HCC血浆hsa_circ_0003998的相对表达中位值(2-△△CT=2.5)分为高、低表达组，Kaplan-Meier分析显示低表达组的总生存时间(overall survival,OS)显著长于高表达组(34.91±1.75 vs 27.26±1.82，P=0.002，图3)。

2.6 预后单因素分析

单因素分析显示，AFP(P=0.004)、TNM分期(P=0.013)和hsa_circ_0003998表达水平(P=0.003)为影响HCC预后的相关因素(表2)。

2.7 预后多因素分析

将单因素分析有统计学意义的因素引入多因素COX模型进行分析，结果显示，hsa_circ_0003998表达水平(P=0.041)和AFP(P=0.039)是影响HCC预后的独立危险因素(表2)。

图3 hsa_circ_0003998表达水平与HCC患者OS的关系

表2 原发性肝细胞癌患者预后的单因素与多因素分析

图4 预测hsa_circ_0003998的潜在靶标miRNA

3 讨论

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，HCC是其主要病理类型，具有恶性程度高、侵袭能力强、进展迅速和预后差等特点，其死亡率在我国消化系统恶性肿瘤中位居第二位，仅次于胃癌[14]。早期根治性切除是目前治疗原发性肝癌最有效的方法，因此早期诊断成为早期治疗的关键。目前主要是通过血清AFP检测联合影像学检查来进行原发性肝癌的早期诊断，血清AFP是首选的原发性肝癌肿瘤标志物，但存在一定的局限性，约有30%-40%的原发性肝癌患者的AFP检测结果为阴性[15,16]，从而引起漏诊；而在肝炎、肝硬化及胚胎性肿瘤患者的血清中AFP水平会增高，这些原因导致AFP无法成为早期筛查原发性肝癌的理想指标[17]。

circRNA是一类特殊的非编码RNA分子，通过非线性反向剪接形成闭合状结构，其表达具有组织特异性和高度保守性等特点，在转录、翻译等生物过程中发挥重要作用[8,18]。近期研究发现，circRNA可发挥miRNA“海绵”作用，解除miRNA对其靶基因的抑制[19]；可与RNA聚合酶II结合促进基因转录[20]；可充当RNA结合蛋白(RNA-binding protein,RBP)海绵，调控相关蛋白质的活性[21]，在恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用[22,23]。某些特定的circRNA可在人血浆、唾液及其他体液中稳定表达，为其作为疾病诊断标志物奠定了基础，如Huang等[24]发现胃癌患者血浆中hsa_circ_0000745的表达水平显著低于健康人，其联合CEA检测有较好的早期诊断价值，可作为胃癌早期诊断的一种潜在分子标志物。

本研究中，我们通过RNA-seq发现了显著高表达于有门静脉侵犯的HCC癌组织的circRNA—hsa_circ_0003998，进一步研究发现HCC血浆hsa_circ_0003998的表达水平显著高于乙型肝炎和健康人，并且hsa_circ_0003998表达水平与患者的AFP、肿瘤直径、TNM分期及组织分化程度显著相关，hsa_circ_0003998高表达的患者，其AFP较高、肿瘤直径较大、TNM分期较晚及组织分化程度较低，表明hsa_circ_0003998可能与HCC的发生发展密切相关。

进一步对hsa_circ_0003998作为HCC潜在的诊断及预后分子标志物进行了初步评价，结果显示血浆hsa_circ_0003998在用于区别HCC与乙型肝炎及健康人时，具有较好的诊断价值，可作为一种新的潜在的原发性肝癌肿瘤标志物继续研究探索。通过预后分析发现，血浆hsa_circ_0003998高表达患者的总生存时间显著短于低表达患者，并且hsa_circ_0003998和AFP是影响HCC患者预后的独立危险因素。由此提示，hsa_circ_0003998可作为HCC诊断和预后评估的生物学标志物。

经过生物信息学软件预测可知，miR-326、miR-330和miR-636可能是hsa_circ_0003998的潜在靶标(图4)。Yu W等[25]研究发现，在非小细胞肺癌中hsa_circ_0003998通过miRNA“海绵”作用吸附miR-326，从而调控Notch1基因的表达，促进肺癌细胞的增殖、侵袭。因此miR-326可能作为hsa_circ_0003998在HCC中的潜在靶标进行后续研究。

综上所述，hsa_circ_0003998可能作为一种新的生物学标志物用于HCC患者的早期诊断和预后评估。