血清miR—125a表达水平在慢性阻塞性肺疾病早期诊断中的应用价值

刘士平 王晓鹏 匡秋江

[摘要]目的 探究血清miR-125a作為生物标志物在慢性阻塞性肺疾病（COPD）早期诊断中的价值。方法 选取2017年1月～2018年6月我院收治的50例COPD患者作为COPD组，另选取同期50例正常人群作为健康对照组，50例重度吸烟者作为重度吸烟组。收集三组的外周血清标本及临床基本资料，运用实时荧光定量法检测三组的外周血清miR-125a表达水平，对血清miR-125a表达进行ROC曲线分析，并记录三组的创面愈合率。结果 COPD组血清miR-125a的mRNA表达水平明显低于重度吸烟组，重度吸烟组血清miR-125a的mRNA表达水平显著低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。重度吸烟组ROC曲线下的面积大于COPD组，COPD组ROC曲线下的面积大于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。重度吸烟组、COPD组的创面愈合率均低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 血清miR-125a在COPD和重度吸烟患者中的表达水平均降低，可将血清miR-125a作为COPD早期诊断的生物标志物，为预防提供依据。

[关键词]慢性阻塞性肺疾病；miR-125a；生物标志物；早期诊断

[中图分类号] R733.7 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）4（c）-0008-04

Application value of serum miR-125a expression level in the early diagnosis of chronic obstructive pulmonary disease

LIU Shi-ping WANG Xiao-peng KUANG Qiu-jiang LIAO Xiao-hong ZHANG Rong-shan

Department of Geriatrics， Cangzhou People′s Hospital， Jiangxi Province， Ganzhou 341000， China

[Abstract] Objective To investigate the value of serum miR-125a as a biomarker in the early diagnosis of chronic obstructive pulmonary disease （COPD）. Methods A total of 50 patients with COPD who were admitted to our hospital from January 2017 to June 2018 were selected as the COPD group. Another 50 normal people were selected as the healthy control group and 50 severe smokers were used as the severe smoking group. The peripheral serum samples and clinical basic data were collected of three groups. The expression levels of miR-125a in peripheral blood of the three groups were detected by real-time fluorescence quantitative method， the ROC curve of serum miR-125a expression was analyzed and the wound healing rate of the three groups was recorded. Results The mRNA expression level of serum miR-125a in the COPD group was significantly lower than that in the severe smoking group， the mRNA expression level of miR-125a in the severe smoking group was significantly lower than that in the healthy control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The area under the ROC curve of the severe smoking group was larger than that of the COPD group， and the area under the ROC curve of the COPD group was larger than that of the healthy control group， with statistically significant differences （P<0.05）. The wound healing rate of the severe smoking group and the COPD group was lower than that of the healthy control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The expression levels of serum miR-125a decrease in patients with COPD and severe smoking， and serum miR-125a can be used as a biomarker for the early diagnosis of COPD to provide a basis for prevention.

[Key words] Chronic obstructive pulmonary disease； miR-125a； Biomarkers； Early diagnosis

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonarydisease，COPD）是全球肺部疾病患者死因之一，其通过对气道的破坏，以肺实质和肺血管的慢性炎症为主要特征，呼吸道气流出现受限不完全可逆、进行性加重现象，发病率逐年上升[1]。目前对于COPD的治疗手段尚不完善，但可在控制疾病的发生对COPD进行预防。在患者和高危人群中寻找分子生物标志物，有助于早期筛查相关疾病[2]。研究表明，血液循环中的血清miR-125a水平mRNA表达，象征疾病的发生和发展阶段。血液样品在临床易于获取，mRNA在血清及血浆中可以抵抗内源性RNA酶而非常稳定地存在，其可在多种储存条件和反复冻融情况下保持稳定[3-4]。近年来研究表明，miR-125a通过靶向效应器程序来稳定调节性T细胞介导的免疫稳态[5]，COPD是一种慢性炎症性疾病，主要涉及T淋巴细胞浸润，而T淋巴细胞属于机体免疫应答的重要部分[6-7]。本研究分别对COPD患者、重度吸烟者、正常人群的外周血清miR-125a的表达水平进行检测，旨在探究外周血清miR-125a在患者和高危人群的早期诊断价值，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2017年1月～2018年6月我院收治的50例COPD患者作为COPD组，另选取同期50例正常人群作为健康对照组，50例重度吸烟者作为重度吸烟组。健康对照组中，男28例，女22例；年龄20～60岁，平均（38.61±5.26）岁。重度吸烟组中，男28例，女22例，年龄21～61岁，平均（38.65±5.21）岁。COPD组中，男28例，女22例，年龄22～60岁，平均（37.25±4.32）岁。三组的一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究中所有参与者均签署知情同意书，并且经医院医学伦理委员会审核批准。

1.2方法

1.2.1血清采集及存放 清晨釆集三组5 ml空腹静脉血，室温下静置60 min进行低温离心，收集上清液分装在0.6 ml无酶管中，编号后，放于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2血清miR-125a的mRNA提取（TRIZOL法） 由于血清中尚无稳定及丰富表达的基因作内参，参照文献[8-9]的方法具体如下。①室温下融化血清，混匀后进行离心，将250 μl血清转移新到新的2 ml无酶管中之后加入20 nmol cel-mir393p（百奥斯生物科技有限公司，编号：BA0440），混匀。②加500 μl TRIZOL（Bio-Rad）（上海联硕生物科技有限公司，批号：15596026），混匀，室温静置10 min，离心10 min，取上清液体转移入新EP管。③加200 μl氯仿，剧烈振荡，时间为30～60 s，随后需要室温放置3 min，低温离心10 min（4℃，12 000 r/min）；小心吸取上层水相转移到干净的离心管中，加0.5倍的无水乙醇，混匀。④过滤后吸附柱直接放入收集管中，将③步骤的液体直接转移到吸附柱中，静置大约5 min，低温离心，离心5 min（4℃，12 000 r/min）。⑤倒掉收集管中的过滤液，在吸附柱中加入500 μl PRE溶液，稀释，静置2 min，常温离心30 s（12 000 r/min），倒掉收集管中的废液，并重复此步骤一次。⑥吸附柱合上收集管一起采用离心机低温离心2 min（4℃，12 000 r/min）。将吸附柱转移到新的无酶管中，在吸附柱中央吸附膜处直接加入无酶水40 μl（注意全部浸湿中央吸附膜），静置5 min，低温离心机离心2 min（4℃，12 000 r/min）。管中有溶解RNA的溶液，编号后直接放入-20℃冰箱进行保存，方便开展后续试验。

1.2.3血清miR-125a的mRNA逆转录 本研究可在生物信息网站查得待扩增的mRNA茎环结构的基因序列，利用Oligo 6引物设计軟件设计上下游引物（即在3′端增加碱基）。按照TaKaRa公司的逆转录试剂盒（上海善然生物科技有限公司，批号：RR037A）说明书进行逆转录，合成cDNA。

1.2.4实时定量PCR法检测血清miR-125a ①应用Takara公司的SYBR Premix Ex Taq产品进行实时PCR反应；②进行PCR反应，程序如下：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，34 s（收集荧光）；40个循环；按照这个反应程序建立熔解曲线。以cel-mir39作为内参，通过2-ΔΔCT法计算目标mRNA表达水平的差异。其中ΔΔCt=ΔCt（实验样品）-ΔCt（基准样品），ΔCt（实验样本）=Ct（目的基因）-Ct（内参基因），ΔCt（基准样品）=Ct（目的基因）-Ct（内参基因），2-ΔΔCt=2-（-1.2）=2.30[8-9]。

1.2.5划痕实验检测细胞迁移能力 ①细胞培养、处理：选取生长期稳定转染细胞，进行胰酶消化后，在常温状态下进行离心，并接种于孔板中，放置在温育箱内进行孵育；②实验：在光镜下对细胞进行观察，待选取细胞完全长满孔后，将直尺架于各孔板间，使用10 μl枪头垂直于孔板底部进行划痕，3条痕迹/孔。对各孔进行清洗，弃含有脱落细胞的清洗液。将选取细胞治愈光镜下取图拍照，每孔选择5个固定部位，对划痕进行测量。测量完毕将孔板继续放置于温育箱内，1、2 d后重复清洗步骤，获取划痕平均值。

1.3观察指标

对三组血清miR-125a的mRNA表达水平进行评估，并观察ROC曲线，ROC曲线是以真阳性率为纵坐标，假阳性率为横坐标绘制的曲线，可比较不同诊断试验对疾病的识别能力。在光镜下对划痕宽度进行测量，计算细胞间距离求取均值，计算三组的创面愈合率，通过创面愈合率判断细胞的迁移能力。

1.4统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1三组血清miR-125a mRNA表达水平的比较

COPD组血清miR-125a的mRNA表达水平明显低于重度吸烟组，重度吸烟组血清miR-125a的mRNA表达水平显著低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.2三组血清miR-125a mRNA表达水平的ROC曲线

重度吸烟组ROC曲线下的面积大于COPD组，COPD组ROC曲线下的面积大于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（图1）。

2.3三组创面愈合率的比较

重度吸烟组、COPD组的创面愈合率均低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

3讨论

COPD的病理机制目前尚不清楚，但研究发现引发COPD的原因较多，常见炎症反应、氧化应激、蛋白酶抗蛋白酶失调、自身免疫失常等[10-11]。研究表明，多种疾病均可导致miR-125a的mRNA表达水平下降，mRNA除可上调STAT3、IFNγ和IL13表达，还可打破调节性T细胞介导的免疫平衡[12-13]。

研究表明，在COPD患者中，吸烟导致COPD加重的原因主要与机体氧化应激反应有关[14]，氧化应激反应可对机体气道和肺组织产生直接的损害，加速炎症反应。本研究人群中严重吸烟者的血清miR-125a的mRNA表达水平更低。研究表明，吸烟可致氧化应激水平失调，加速炎症水平，增加疾病进展[15]。因此吸烟作为COPD的高危因素，加速疾病进展的同时，使患者外周血清miR-125a的mRNA表达水平下降，其具体机制尚需要进一步的研究。

ROC曲线是以真阳性率为纵坐标，假阳性率为横坐标绘制的曲线，可比较不同诊断试验对疾病的识别能力。本研究结果显示，重度吸烟组ROC曲线下的面积大于COPD组，COPD组ROC曲线下的面积大于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05），提示重度吸烟组血清mRNA的表达水平作为COPD疾病生物标志物具有早期诊断的价值，值得临床推广应用[14-16]。划痕实验结果显示，血清miR-125a的mRNA表达水平越高，细胞迁移能力越快。因此miR-125a的mRNA表达水平可作为检测COPD患者的重要依据，但血清mRNA可同时靶向多个基因组分，对机体各通路的调控较为复杂，要在研究中明确mRNA与各细胞的具体发展机制和完整的靶向通路，需进一步进行深入研究。COPD组血清miR-125a的mRNA表达水平明显低于重度吸烟组，重度吸烟组血清miR-125a的mRNA表达水平显著低于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。在进行检查中，心肌细胞内含有各种抗体组分，且COPD患者在发病过程中，心脏功能出现明显变化，随着COPD患者病情的加重，miR-125a的mRNA表达水平明显降低，进一步提示miR-125a的mRNA表达水平在COPD患者诊断中的价值[17-18]。

综上所述，相对于健康人群，COPD患者和重度吸烟高危患者中外周血清miR-125a的mRNA表达水平均下降，提示疾病早期存在血清miR-125a的mRNA表达水平异常。且吸烟可加速疾病进展，导致外周血清miR-125a的mRNA表达水平下降。经过ROC曲线的敏感性和特异性分析，外周血清miR-125a的mRNA表达水平作为生物标志物在重度吸烟的高危患者均优于COPD患者和健康者，提示可将血清miR-125a作为COPD早期诊断的生物标志物，为疾病预防和阻止进展提供依据。

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（收稿日期：2018-09-05 本文编辑：任秀兰）