固相萃取-反相高效液相色谱法对泼尼松龙片剂有效含量的测定

张 慧

（浙江仙琚制药股份有限公司，浙江 仙居 317300）

泼尼松龙 （Prednisolone），化学名 11β,17α,21-三羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮，为泼尼松的一种活性代谢产物，是一种合成用副肾皮质荷尔蒙制剂，具有抗炎、抑制免疫、抗病毒和抗休克等功效而广泛用于临床治疗。目前国内对泼尼松龙的检测报道很多[1-3]，检测方法也较为成熟，针对不同的样品有不同的前处理方法。食品化妆品等复杂基质的残留泼尼松龙大都采用固相萃取技术净化和浓缩[3-4]，而药物类基质样品的泼尼松龙残留采用有机溶剂溶解后直接进样[5]，并未采用固相萃取技术，因而不易净化，容易产生基质干扰。固相萃取技术作为一种高效实用的前处理技术，已经被广泛应用于食品和环境样品等的检测。本文拟将固相萃取技术用于药物类基质中的泼尼松龙残留提取与净化，然后用反相高效液相色谱检测。该方法不易产生干扰，重复性好，灵敏度高，可用于原料药及药品中泼尼松龙及有关物质的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

美国Agilent公司1100型液相色谱仪，配在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱及紫外检测器（VWD）。高纯水发生器（Milli-Q，美国MILLIPORE公司）。高速冷冻离心机 (Sigma 3k-30)。氮吹仪 (N-EVAP111，美国Organomation公司)。Oasis HLB固相萃取柱(6mL，150mg，美国Waters公司)，使用前分别用5mL甲醇和5mL水活化。泼尼松龙标准品（Sigma-Aldrich公司，纯度＞98%）。甲醇色谱纯(美国TEDIA公司)，其他试剂为分析纯。

1.2 溶液配置

标准溶液：称取泼尼松龙标准品0.0100g(准确至0.0001g)，用甲醇溶液定容到10mL，配置成浓度为1.0mg/mL的储备液，于-18℃冰箱保存。临用时用流动相稀释成相应的标准工作液曲线。

乙酸-乙酸钠缓冲溶液液 (pH=5.2)：吸取5.72mL冰乙酸至500mL容量瓶，定容到刻度。称取27.22g三水乙酸钠，用水溶解后定容到1000mL容量瓶。分别量取上述溶液21mL和79mL混合，用乙酸调pH值到5.2。

1.3 色谱条件

色谱柱为 C18(Inertsil ODS-SP 5μm 4.6×150mm，日本岛津)；保护预柱为C18(Eclipse XDB 5μm 4.6mm×12.5mm，美国 Agilent)；流动相：甲醇/0.1%甲酸水溶液 (体积比为60/40)，流速1.0mL/min，柱温40℃，检测波长247nm，进样量10μL。标准色谱图和样品色谱图见图1和图2。

图1 标准品

图2 样品

1.4 样品前处理

准确称取0.1g研磨好的药品试剂 (精确到0.01g)于15mL离心管中，依次加入2mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液、3mL甲醇充分震荡混匀，用离心机在4℃1000r/min离心10min，上清液转入15mL离心管待净化。重复上述过程，合并上清液，用甲醇定容到10mL。取活化好的HLB固相萃取小柱，准确吸取1mL上述待净化液体以1mL/min的流速上样，然后依次用5mL水，3mL 30%甲醇淋洗，弃去全部淋洗液，减压抽干。用2mL甲醇洗脱，收集洗脱液，用色谱流动相定容到10mL,过0.45μm滤膜供液相色谱检测。

2 结果与讨论

2.1 线性相关性及其检测限

将质量浓度为1.0mg/mL的储备液恢复到室温，用流动相配制成质量浓度为100μ/mL的工作液。上述工作液用流动相稀释成质量浓度为10、30、50、80和100μg/mL的工作曲线，在上述色谱条件下检测。泼尼松龙的线性方程为Y=-18.2563+15.2520×X，相关系数r=0.99919。最低检出限为1mg/g(S/N=3)。

2.2 固相萃取条件的优化

由于泼尼松龙片剂含有大量淀粉和乳糖等，会形成基质干扰，必须对其进行净化处理。按照传统经典的方法，本研究采用固相萃取技术来净化。以市售泼尼松龙片为样品基质，采用HLB SPE小柱的净化。结果显示，采用HLB小柱的回收率为 87.4%～93.7%。将提取液上柱后，分别采用1、2、3和4mL甲醇进行淋洗。结果表明，采用2mL甲醇洗脱回收率最优，淋洗体积继续增加，回收率没有显著变化。

2.3 方法的精密度和回收率

在不含泼尼松龙片剂的空白基质 (含淀粉、乳糖等)上添加质量浓度为10.0mg/g、20.0mg/g和50.0mg/g的质量浓度水平，各平行3次，计算其回收率，结果表明回收率范围在87.4%～93.7%，见表1。

表2 泼尼松龙片加标回收试验 (n=9)

2.4 讨论

采用固相萃取技术来净化泼尼松龙片剂中杂质，富集泼尼松龙化合物，然后用液相色谱检测泼尼松龙的浓度。通过优化淋洗体积优化萃取条件，使回收率达到87.4%～93.7%。同时建立液相色谱分析条件，最低检出限达到1mg/g。实验结果证明，该方法杂质干扰少，重复性好，简单快捷，可用于药品中泼尼松龙的定性定量检测。