汉族和维吾尔族原发性胆汁性肝硬化与UGT1A1基因多态性相关性分析

吴雷琪,李鸣远,李倩,米娜瓦尔·胡加艾合买提

原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种慢性的进行性肝病，其发病特点是免疫介导的肝内小胆管的进行性炎症性破坏，导致胆汁淤积，纤维化，肝硬化，并最终致使肝功能衰竭，由于线粒体/核蛋白相关的自身抗体与PBC发病机制密切相关，因此也被认为是器官特异性自身免疫性疾病[1-3]。尽管大量研究表明遗传因素能够导致疾病易感性和严重程度[4]，但PBC的发病原因仍然知之甚少。

UGT1A1是胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(B-UGT)的编码基因，其影响B-UGT的活性并参与肝脏中胆红素葡萄糖醛酸化反应。研究表明，UGT1A1突变与胆囊结石和肝内胆管结石的形成密切相关[5-6]，其机制可能是UGT1A1基因突变引起胆红素代谢障碍，从而改变胆汁中双结合胆红素、单结合胆红素及游离胆红素的构成比例，最终促使成石胆汁形成。由于PBC患者血清中胆红素水平通常会升高，而胆红素的代谢与UGT1A1基因的多态性有关[7-8]，因此推测UGT1A1多态性可能影响原发性胆汁性肝硬化的发生。而UGT1A1基因突变通常位于第一外显子211 bp处的G/A碱基(UGT1A1*6位点)，分为GG、GA和AA三种基因型，且仅发生在亚洲人群中[9]。因此，为研究汉族和维吾尔族PBC患者发病风险与UGT1A1基因多态性的联系，本研究收集2013年9月至2018年3月收住本院的PBC患者的临床资料及血液样本，检测UGT1A1基多态性与PBC发病的相关性，为原发性胆汁性肝硬化的防治提供更多的临床依据。

1 材料方法

1.1 材料

血液基因组DNA提取试剂盒购、DNA纯化试剂盒及琼脂糖均购自美国sigma公司；PCR扩增试剂盒(包括2×buffer缓冲液、dNTPs、MgSO4和高保真酶)购自日本takara公司。

1.2 样本资料

本研究经我院医学伦理委员会批准，收集2013年9月-2018年3月我院就诊的PBC患者共159例，其中汉族PBC患者117例、包括男52例、女65例，平均年龄(56.1±8.42)岁；维吾尔族PBC患者42例，包括男19例、女23例，平均年龄(54.5±9.11)岁。所有PBC患者符合美国肝病研究学会(AASLD)的PBC诊断标准[10]。根据肝活检结果和临床表现，将PBC患者分为早期PBC患者：活检证实Scheuer1期、2期或没有任何体征表明有门静脉高压或肝硬化；以及晚期PBC患者：活检证实Scheuer3期、4期或有迹象表明门静脉高压，肝硬化或出现持续性黄疸。汉族早期和晚期PBC患者分别为78例和39例，维吾尔族早期和晚期PBC患者分别为25例和17例。选择同期于我院就诊的182例健康体检人群作为对照组，其中145例为汉族，包括男82例、女63例，平均年龄(52.9±8.01)岁；37例为维吾尔族，包括男22例、女15例，平均年龄(54.8±8.35)岁。PBC患者及对照组之间年龄、性别均无显著性差异(P>0.05)，所有入选的研究对象均签署知情同意书。

1.3 UGT1A1基因多态性检测

采用含有EDTA的离心管收集PBC患者及对照组人群的外周静脉血，并置于-20 ℃保存。提取全血基因组DNA并利用PCR结合测序分型技术检测UGT1A1基因的多态性。用于UGT1A1基因UGT1A1*6位点的PCR扩增的上游引物F：5′-ACGCCTCGTTGTACATCAGAG-3′, 下游引物R：5′-TCCTTGTTGTGCAGTAAGTGG-3′。采用PCR技术扩增UGT1A1基因，20 μL反应体系包括：40 ng基因组DNA、10×反应缓冲液2 μL、2 mM dNTPs 2 μL、25 mM MgSO4μL、上下游引物各0.5 μL、高保真酶0.5 μL、灭菌双蒸水补齐体系至20 μL。扩增后，回收PCR扩增产物并送至上海生工公司测序。UGT1A1基因的3种基因型分别为G/G、G/A和A/A，根据测序结果对PBC患者及健康人群的UGT1A1基因型进行统计。

1.4 统计方法

2 结果

2.1 UGT1A1基因UGT1A1*6位点的遗传平衡性检测及基因分型结果

根据测序结果统计UGT1A1基因UGT1A1*6位点的3种基因型频率，如图1和表1所示。汉族和维吾尔族健康人群和PBC患者的UGT1A1的基因型分布均达到遗传平衡(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，具有群体代表性。

图1 UGT1A1基因 UGT1A1*6位点的基因型测序分型结果

民族组别nGGGAAA 2值P值汉族对照组14575(51.7)28(19.3)42(29.0)33.7770.001PBC组11721(17.9)49(41.9)47(40.2)维吾尔族对照组3719(51.4)8(21.6)10(27.0)7.8330.020PBC组4210(23.8)20(47.6)12(28.6)

汉族PBC患者的GA和AA基因型频率均高于对照组人群(41.9%vs19.3%，40.2%vs29.0%)，维吾尔族PBC患者的GA基因型频率高于对照组人群(47.6%vs21.6%)，且汉族和维吾尔族对照组健康人群与PBC患者之间的基因型分布均存在显著性差异(P均< 0.05)，提示UGT1A1*6的GA和AA基因型可能与汉族和维吾尔族人群的PBC发病有关。

2.2 汉族及维吾尔族人群UGT1A1基因在PBC早、晚期的基因型分布及比较

如表2所示，比较分析汉族及维吾尔族PBC患者UGT1A1基因的多态性，发现其UGT1A1*6位点的三种基因型分布无显著性差异(P>0.05)，提示PBC发病与汉族和维吾尔族人群UGT1A1基因的多态性无关，无地区和人种限制。进一步分析早、晚期PBC患者UGT1A1*6的多态性，发现汉族和维吾尔族早期PBC患者UGT1A1*6的基因型分布无明显差异(P>0.05)，而汉族和维吾尔族晚期PBC患者UGT1A1*6的基因型分布呈显著性差异(P<0.05)，其中汉族PBC患者的GG基因型频率17.9%明显高于维吾尔族0%，而其GA基因型频率38.5%则明显低于维吾尔族70.6%，表明相较于汉族PBC患者，含有UGT1A1*6 GA基因型的PBC患者人群更易出现在维吾尔族人群中，提示汉族及维吾尔族人群PBC的晚期发病与UGT1A1*6基因型分布有关。

表2 汉族与维吾尔族PBC患者UGT1A1*6位点基因型频率的比较分析 [n(%)]

3 讨论

原发性胆汁性肝硬化(PBC)为慢性进行性的非化脓性胆管炎性疾病。随着环境的污染和生活方式的西化，以及该疾病知识的普及，PBC的检出率逐年上升[11]。目前研究认为，PBC是在经免疫介导的环境和遗传基因等因素共同作用下发生的，基因因素导致的疾病易感性在其发病机制中作用重大[12]。UGT1A1基因负责编码UDP-葡萄糖醛酸转移酶，能够通过葡萄糖醛酸化途径将小亲脂性分子如类固醇，胆红素，激素和药物转化为水溶性可排泄代谢物[13-14]。研究表明，UGT1A1基因编码的蛋白对于自身免疫性肝炎2型患者的抗UGT阳性血清具有较强的免疫反应[15]。以上依据提示，UGT1A1基因可能参与自免疫调节，并通过自免疫机制参与肝脏中胆汁的排放。而迄今为止，并未有研究报道UGT1A1基因与PBC发病的关系。本研究通过采集PBC患者和健康人群的血液DNA进行UGT1A1的基因多态性分析，发现汉族PBC患者的GA和AA基因型频率均高于对照组人群，维吾尔族PBC患者的GA基因型频率高于对照组人群，且汉族和维吾尔族对照组健康人群与PBC患者之间的基因型分布均存在显著性差异，提示UGT1A1*6的GA和AA基因型可能与汉族和维吾尔族人群的PBC发病有关。

大量研究报道，UGT1A1基因多态性能够反应结直肠癌、肺癌和妇科癌症等患者治疗过程中伊立替康诱导的毒性，而仅在伊立替康治疗的韩国结肠癌患者中发现UGT1A1基因UGT1A1*6突变体与患者白细胞严重减少相关[16-19]，提示UGT1A1基因多态性可能影响患者的药物排泄功能且与患者种族相关。本研究通过比较汉族和维吾尔族PBC患者的UGT1A1基因多态性，发现UGT1A1*6位点的三种基因型在汉族和维吾尔族人群中无显著性差异，提示UGT1A1基因多态性与PBC发病的关系可能不受地区和人种的限制，这与罗德梅等[20]的报道一致。孟新艳等[21]通过检测汉族和维吾尔族PBC患者的GP210、sp100和AMA-M2抗体，发现GP210和SP100在维吾尔族PBC患者中的阳性率显著高于汉族，提示维族人群更易发生PBC。本研究发现尽管UGT1A1基因多态性与汉族和维族总体PBC患者的发病无关，但在晚期PBC患者中，GA基因型的维族PBC患者比例明显高于汉族，且具有显著性差异，提示UGT1A1基因多态性与晚期PBC的发生与人种和地区有关，提示含有GA基因型的维吾尔族人群更易加剧PBC的恶化。

综上所述，本研究通过分别比较PBC患者和健康人群、及早、晚PBC患者UGT1A1基因在不同种族中的多态性，证实UGT1A1*6位点的基因型分布与汉族和维吾尔族PBC患者的遗传易感性和发病相关，且含有GA基因型的晚期PBC患者更易发生在维吾尔族人群中，为PBC治疗提供一定的理论依据。