吡格列酮对X线照射后成纤维细胞分泌的基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶抑制物-1表达的影响

张一思，刘秀丽，潘洁，刘思涵，王文闻

(哈尔滨医科大学附属第一医院肿瘤一科，哈尔滨 150001)

X线放射治疗是临床治疗恶性肿瘤的常见手段。射线除了对肿瘤细胞具有杀伤作用，还可能对正常组织有损伤，其中较严重的放射性损伤为炎性损伤和纤维化损伤。过氧化物酶体增殖因子活化受体γ(PPAR-γ)可以调节糖脂类的代谢及血管的炎性增殖等关键蛋白的基因表达，对非放疗导致的炎性反应及间质纤维化有抑制作用。但PPAR-γ对放疗导致的纤维化损伤及炎性损伤方面尚无太多报道。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)高表达可导致胶原系统破坏及变性胶原纤维增多。TIMPs家族中的组织金属蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)是组织中MMPs的特异性抑制物之一。TIMPs与MMPs在体内的平衡是保障组织细胞的增殖、凋亡及细胞外基质稳态的重要条件。本文拟观察正常小鼠L929细胞受到X线照射后分泌的MMP-9和TIMP-1表达的变化，及加入PPAR-γ配体吡格列酮活化L929细胞后对以上因子表达的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞获取及种植 L929细胞购自上海细胞库(批号：170622)。使用复苏后第3～10代细胞，细胞密度为2×104/mL。按每孔200 μL接种于96孔板中。每组设5个重复孔。将胰酶加入10 %胎牛血清+1 %青链霉素+RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute,洛斯维·帕克纪念研究所)培养液，消化3 min，放入离心机(离心半径15 cm,转速1000 r/min)离心5 min，弃上清，加培养液吹打成细胞悬液，移至培养瓶，放入5 % CO2、37 ℃的CO2孵箱。采用RT-PCR法证实L929细胞中是否存在PPAR-γ表达。

1.2 细胞照射及药物处理 采用X线(剂量率450 cGy/min，10 Gy)于室温下对L929细胞分别照射。L929细胞生长至90 %融合状态时更换0.1 %胎牛血清培养基孵育24 h，使细胞不处于增殖状态，用RT-PCR方法观察照射前与照射后0 h、2 h、7 h、24 h和48 h时 L929细胞中的MMP-9，TIMP-1的表达情况。再给予上述L929细胞以吡格列酮(北京太洋药业股份有限公司，批号:161008)，30 μmol/L处理10 h后照射，照射结束后不更换培养基，将细胞送回CO2孵箱，按实验设计时间收取样品。用RT-PCR方法观察照射48 h时L929细胞中的MMP-9，TIMP-1表达。用二甲基亚砜(DMSO)溶解PPAR-γ配体，DMSO终浓度<1‰。

1.3 细胞总RNA提取 处理后的L929细胞去除培养基，PBS冲洗2次置于直径10 cm培养皿中，加入1 mL Trizol在室温下轻摇培养皿5 min；再移至离心管中加入200 μL氯仿震动15 s，室温下放置3 min后离心(离心半径15 cm,转速12 000 r/min，4℃)15 min。吸出上层水相移至离心管，再加入0.5 mL异丙醇，充分混匀后于室温下搁置10 min再离心(离心半径15 cm,转速12 000 r/min，4 ℃)10 min，弃上清；RNA沉于管底，用1 mL 75 %乙醇轻轻冲洗后再离心(离心半径15 cm,转速8 000 r/min，4 ℃)5 min，弃上清；再加入DMSO的0.9%氯化钠注射溶液溶解RNA，采用酶标仪A260、A280检测RNA的纯度和浓度。样本用后至于-80 ℃冰箱长期保存。

1.4 RT-PCR方法 取500 μg的RNA样品反转录成cDNA(complementary DNA，互补DNA)，按逆转录试剂盒(TaKaRa:DRR037A)说明书进行规范化操作，于总反应体积10 μL中加入反转录酶和引物，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，得到cDNA。PCR扩增：用扩增试剂盒(TaKaRa:DRR003A)中PremixTaq 12.5 mL得到的cDNA 2 μL，上下游引物(20 μM)各0.5 μL，补足灭菌蒸馏水至25 μL。引物序列分别为:PPAR-γ顺式5′-TTTTCAAGGGTGCCAGTTC-3′，反式5′AATCCTTGGCCCTCTGAGAT-3′，扩增片断长198 bp。MMP-9顺式5′-TTCACCGGCTAAACCACCTC-3′反式5′-CATGCATGTGAACATAACCTCA-3′扩增片断长73 bp。TIMP-1顺式5′-ACAGACAGCCTTCTGCAACTCPC-3′，反式5′-ACTGCGGTTCTGGGACTTG-3′，扩增片断长217 bp。GAPDH顺式5′-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3′，反式5′GGACACATTGGGGGTAGGAACA-3′，扩增片断长225 bp。反应条件为95 ℃，5 s一个循环，95 ℃，5 s；55 ℃，30 s；70 ℃，30 s，30个循环。用3%的琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物。用凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)分析结果。内参照为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。

1.5 统计学处理 用SPSS 11.5软件对不同时点MMP-9、TIMP-1的电泳结果数据进行方差分析，结果有差异后采用LSD法进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PPAR-γ表达 RT-PCR的电泳结果显示，L929细胞中存在PPAR-γ的表达，如图1所示。

图1 L929细胞表达PPAR-γ的电泳图

2.2 单纯照射的RT-PCR结果 经X线照射不同时间L929细胞中MMP-9的电泳结果显示，未经照射(0 h)的L929细胞和经X线照射的L929细胞胞核中都有MMP-9的表达，照射后0 h、2 h、7 h、24 h、48 h每一时间点与照射前的MMP-9表达比较，差异均有统计学意义，P均<0.05；照射后0 h、2 h、7 h、24 h每一时间点与其后各时间点的MMP-9表达比较，差异均有统计学意义，P均<0.05，而且随照射后时间的延长其表达逐渐增加，在10 Gy照射后48 h表达最高(F=4.135，P=0.022)，见图2。X线照射时间对TIMP-1表达的影响规律与MMP-9相反，随照射后时间的延长TIMP-1表达逐渐减少，照射后0 h、2 h、7 h、24 h、48 h每一时间点与照射前的TIMP-1表达比较，差异均有统计学意义，P均<0.05；照射后0 h、2 h、7 h、24 h每一时间点与其后各时间点的TIMP-1表达比较，差异均有统计学意义，P均<0.05，在10 Gy照射后48 h TIMP-1表达最低(F=3.646，P=0.041)，见表1和图3。

表1 不同时点L929细胞中MMP-9、TIMP-1表达的比较

注：MMP-9为基质金属蛋白酶-9，TIMP-1为基质金属蛋白酶抑制物-1，下表、图同；与其照射后各时间点同指标的比较，aP<0.05；与其后各时间点同指标的比较，bP<0.05

注：GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，下图同

图2不同剂量X线照射不同时间后L929细胞MMP-9 表达的典型电泳结果

图3 不同剂量X线照射不同时间后L929细胞TIMP-1表达的典型电泳结果

2.3 加入吡格列酮后RT-PCR结果 照后48 h 用RT-PCR检测结果显示，吡格列酮降低了10 Gy照射诱导的MMP-9过度表达[0.76∶0.52 (F=3.735,P=0.024)]。吡格列酮升高了10 Gy照射诱导的TIMP-1过度抑制[0.17∶0.27 (F=3.908,P=0.032)]。见图4,5。

注：Pio为吡格列酮；DMSO为二甲基亚砜

图4X线照射后48 h不同处理条件下L929细胞MMP-9表达的典型电泳结果

图5 不同处理条件下L929细胞TINMP-1表达的典型电泳结果

3 讨论

肿瘤放疗过程中组织出现的放射损伤在病理学上表现为慢性炎症和修复共同作用的结果。近年来有研究发现，MMPs与慢性炎性渗出和纤维化关系密切[1-4]。MMPs中MMP-9在多种细胞内具有表达，作用底物广泛。TIMP-1主要来源于L929细胞、各种肿瘤细胞、单核细胞等，其主要功能为调节细胞粘着，参与细胞外基质的降解与重建。TIMP-1是降解Ⅳ型胶原的主要酶，后者是细胞基膜的主要成分，其损伤可导致细胞膜结构异常通透性增高和炎性介质渗出，最终导致细胞外基质沉积纤维化形成。MMP-9在体内的表达受多种因子的调控，包括特异性及非特异性调控因子。其中TIMP-1即为MMP-9的特异性抑制剂[5-6]。

肺纤维化(PF)的发病机制目前尚未完全明确[7]。目前认为，PF为肺间质性疾病。其病理特点为长期的弥漫性肺泡炎症和胞外基质的过度沉积。对PF的治疗尚缺乏有效、且副作用低的药物。近年来PPAR-γ在PF中的作用受到学者们越来越多的关注。PPAR-γ属于有配体激活的Ⅱ核受体超家族，其作用广泛，除了参与脂质代谢和体内糖平衡外，还参与多种疾病的炎症和纤维化过程。PPAR-γ具有抗炎抗纤维化作用[8-10]。

关于PPAR-γ在非放射性导致的炎症和纤维化过程中的作用，现已有不少的报道。已有的研究显示，PPAR-γ配体可抑制MMP-9的表达，促进TIMP-1的表达。Liu等[11]实验中采用大鼠肝纤维化模型来考察羟基红花黄色素A(HSYA)抗肝纤维化的作用机制。其实验结果显示，PPAR-γ信号转导是肝纤维化病程中的关键通路，其在H SYA抑制肝纤维化作用机制中系通过促进PPARγ表达、上调TIMP-1蛋白表达而起到预防肝纤维化的作用。周瑾等[12]实验中考察肾间质L929细胞(NRK-49F)发生表型转化时的MMP-9及其抑制因子TIMP-1表达的变化。其结果表明，TIMP-1基因蛋白表达水平的上调可减少细胞外基质的降解，从而诱导肾间质L929细胞的活化。周晓霞等[13]研究中应用PPARγ激动剂-曲格列酮或GW9662-PPARγ拮抗剂分别对宫颈癌HeLa细胞进行干预。其结果发现，与空白对照组比较,在干预后的不同时点(0、24 h、48 h和72 h)，激动剂组HeLa细胞的活性随时间依赖性降低。其中干预48 h后激动剂组的ICAM-1和MMP-9和蛋白表达均明显降低，而其HeLa细胞PPARγ和蛋白表达和PPARγ 核转位水平均显著增加。该研究结果表明，促进PPARγ表达和PPARγ核转录水平可下调HeLa 细胞ICAM-1和MMP-9的合成,抑制HeLa细胞的增殖。尹鹏等[14]研究中探讨替米沙坦对PPAR-γ及结肠癌SW480细胞TIMP-1表达水平的影响。其结果发现，替米沙坦干预后在不同时点(0、24 h和72 h) SW480细胞活性逐渐降低，而TIMP-1、PPAR-γ和蛋白的表达呈时间依赖性递增。该结果表明，上调PPAR-γ表达可促进结肠癌细胞TIMP-1的合成和分泌,而导致SW480细胞生长和侵袭能力的降低。王闯[15]研究中探讨了肝细胞癌PPARγ/PTEN/MMP-9信号通路的存在及其MMP-9表达水平。其结果发现，经PPARγ配体即15-脱氧-前列腺素J2(15-d-PGJ2)处理后，对肝癌细胞增殖有剂量依赖性的抑制作用，且上调PTEN和蛋白的表达，减少MMP-9和蛋白的表达；而PPARγ抑制剂GW9662可扭转这一作用。该结果表明，通过PPARγ/PTEN/MMP-9信号通路下调MMP-9表达可抑制肝癌细胞的侵袭和转移。还有其他学者的研究结果表明，PPAR-γ配体能抑制MMP-9的表达，促进TIMP-1的表达。李春陵等[16]研究中考察丹参酮ⅡA 磺酸钠对慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道重塑大鼠PPARγ和核因子-κB 表达的作用。其结果显示，经丹参酮ⅡA 磺酸钠干预后大鼠血清MMP-9等含量明显降低，而TIMP-1、TIMP-2表达明显升高。该结果表明，调节 PPARγ表达可抑制MMP-9、TIMP-1、TIMP-2等因子的表达水平。Chuang等[17]考察槲皮素代谢产物qP对细胞侵袭和迁移的作用。其结果可见，qP以剂量依赖的方式可抑制MMPs表达和细胞的侵袭和迁移，而PPAR-γ拮抗剂GW9662可对抗这一作用。该结果表明，对PPARγ的上调作用于MMP-9、TIMP-1、TIMP-2等因子从而抑制了细胞的侵袭和迁移。邹娜等[18]研究中对子痫前期患者胎盘组织中的MMP-2、TIMP-2、PPARγ表达及临床意义进行考察。其结果可见，MMP-2的表达水平从正常足月妊娠、到轻度子痫前期、再到重度子痫前期呈下降趋势，而TIMP-2、PPARγ表达水平有升高趋势。其相关性分析结果显示，MMP-2与TIMP-2和PPARγ表达呈负相关。该结果表明，子痫前期患者胎盘组织中可见MMP-2表达的下调，而TIMP-2和PPARγ的表达为上调，可见MMP-2、TIMP-2、PPARγ的表达是负相关的。

如上已有的研究结果均提示，MMP-9、TIMP-1表达水平的变化与非放疗所致的炎性反应、间质纤维化的进程等有关，而PPAR-γ能够调节炎性增殖相关的关键蛋白的基因表达、从而起到抑制炎症和组织纤维化的作用。但目前PPAR-γ在放射导致的炎症和纤维化过程中的作用还少有报道。

本研究中通过添加PPAR-γ配体吡格列酮使其活化后作用于被X线照射后的L929细胞，旨在观察L929细胞分泌MMP-9，TIMP-1表达的变化情况。本研究结果发现，X射线照射L929细胞后出现纤维化相关因子MMP-9表达升高，TIMP-1表达降低。笔者分析，L929细胞受X线照射48 h后出现了早期炎性反应，故MMP-9表达增高，TIMP-1表达降低。

熊园园[19]考察了2型糖尿病患者血清中TIMP-2、hs-CRP及肾脏NF-κB表达的相关性。其结果发现，治疗后NF-κB在吡格列酮组大鼠肾组织中的表达多呈弱阳性，较糖尿病模型组大鼠的表达降低，表明吡格列酮能抑制TIMP-2、NF-κB、hs-CRP等炎性因子的表达，降低血糖,调节机体免疫平衡。刘春丽等[20]考察了吡格列酮对高脂血症大鼠MMP-2、MMP-9表达的作用。其结果可见吡格列酮组大鼠MMP-2、MMP-9表达水平均显著下降，表明吡格列酮可抑制MMP-2、MMP-9表达。在本研究中发现，吡格列酮可使MMP-9高表达降低，使TIMP-1低表达升高，本研究结果表明吡格列酮可以抑制MMP-9表达、促进TIMP-1表达。

徐龙[21]研究中对放疗所致放射性肺纤维化的发生规律与其分子机制进行了考察。其实验中建立了雌性C57BL/6小鼠放射性肺纤维化模型，分别于照射后1、3、6个月观察小鼠肺组织中MMP-9及其抑制剂TIMP-1的表达。其结果可见，照射后小鼠肺组织的MMP-9、TIMP-1表达均显著性增加,随时间延长MMP-9增加更明显。其结果表明，调节肺组织内MMP-9/TIMP-1比例可减轻小鼠放射性肺纤维化的病变程度。在本研究中，将添加PPAR-γ配体的吡格列酮活化后作用于被X线照射后的L929细胞，本研究得到的结果证实TIMP-1为MMP-9的特异性抑制剂、两者在体内表达水平的相反升降趋势，本研究结果也表明PPAR-γ配体吡格列酮对成纤维细胞分泌MMP-9，TIMP-1表达的调节作用。本研究得出的结果与如上已有的文献对于PPAR-γ、MMP-9及TIMP-1的报道均有一定程度的吻合。

综上所述，X线照射初期使L929细胞分泌MMP-9增多，TIMP-1减少，可能促使炎性因子的急性期渗出，最终促进细胞外基质沉积导致纤维化的形成，而PPAR-γ配体吡格列酮可以抑制这种表达，最终可能抑制X线导致的放射性纤维化的损伤反应。