SSR标记技术在“七星”青萝卜杂交种纯度鉴定中的应用

(1.天津科润蔬菜研究所，蔬菜种质创新国家重点实验室，天津市蔬菜遗传育种企业重点实验室，天津 300384；2.天津大学生命科学学院，天津 300072)

萝卜(RaphanussativusL.)又名莱菔，属十字花科萝卜属，是我国重要的蔬菜作物之一。据统计，我国每年萝卜播种面积保持在120万hm2左右，总产量达4 000 t，是仅次于白菜的第二大蔬菜作物[1-2]。“水果萝卜”是人们对萝卜中最适宜生食、味佳形美、可与水果媲美的优良品种类型的统称。肉质翠绿的天津“卫青萝卜”和山东“潍县萝卜”是水果型青萝卜中颇负盛名的2个地方品种[3]。“七星”青萝卜是天津科润蔬菜研究所育成的水果萝卜杂交新品种，其肉质根长圆柱形，外形美观，表皮浅绿色、光滑亮泽，肉色绿，口感脆甜，生食品质极佳，春秋均可种植，近3年在国内累计应用面积已超过2 600 hm2以上[4]。

种子纯度是保证优良品种潜力得以发挥的关键因素，目前传统的种子纯度鉴定方法，仍以田间观察为主，具有工作量大、周期长、易受环境影响等不利因素，由于需要较长的观察周期，还可能错过最佳的销售和播种时间。基因组水平的分子标记具有遗传稳定、多态性高等优点，目前已被广泛应用于蔬菜作物的种子纯度检测当中[5-6]。张小康等[7]利用SSR标记对汉青一号萝卜杂种一代进行纯度鉴定，结果纯度为95.1%，与田间鉴定结果96.0%基本相符。任雪松等[8]利用RAPD标记对胭脂萝卜种子进行纯度鉴定，发现其纯度为72.7%，与田间检测结果一致。本研究通过筛选合适的SSR引物，来完成“七星”青萝卜的种子纯度鉴定，以期为建立准确、高效的杂交种分子纯度鉴定技术体系提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

“七星”青萝卜杂交种及其父母本，市售青萝卜商品种10份，均由天津科润蔬菜研究所大白菜研究室提供。

表1 商品种来源

代号商品名来源1西星萝卜5号山东登海种业股份有限公司2琴萌青青岛国际种苗有限公司3德高青德高蔬菜种苗研究所4喜诺青萝卜青岛金海种苗有限公司5喜诺晓青青岛金海种苗有限公司6喜诺春青绿青岛金海种苗有限公司7苹果脆山东昌邑市隆达种业8青脆甜北京中农金土地农业发展研究中心9菜星青秀山东省泰安菜星种业有限公司10春夏青玉青岛金海种苗有限公司

注：白色箭头指出的为假杂种。图1 引物QX-SSR 1在七星萝卜杂交种群体中的扩增结果

1.2 方 法

1.2.1样品DNA提取

参试材料播种于露地，正常管理，2～3片真叶时采集幼嫩叶片，利用CTAB法提取基因组DNA，具体的步骤为：取幼嫩叶片0.1 g入1.5 mL离心管中，加50μL 2% CTAB提取缓冲液，研磨，后补齐至400μL，65 ℃水浴30 min；加入400μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻摇5 min。12 000 r/min离心5 min；取上清200μL，加入预冷的异丙醇200μL混匀，-20 ℃放置20 min；12 000 r/min离心10 min；弃上清，加入150μL预冷乙醇，轻轻混匀洗净，10 000 r/min离心5 min；弃上清，晾干或吹干；加蒸馏水100μL溶解DNA，室温放置1 h；用蒸馏水将DNA稀释到50 ng/μL，作为PCR模板使用或-20 ℃保存备用。

1.2.2SSR 扩增与电泳分析

采用10μL的反应体系，包括：10×PCR Buffer，1.0μL；2.5 mM dNTP，0.2μL；10μmol/L primers，0.4μL；5 U/μL Taq，0.2μL；50 ng/μL DNA，1.5μL；ddH2O，6.7μL。

PCR扩增采用的程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，35 个循环；72 ℃终延伸5 min。

对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，通过银染后观察结果。

1.2.3引物筛选

根据萝卜基因组信息，设计SSR引物在七星萝卜亲本及F1代间进行筛选，筛选具有共显性差异标记条带的引物进行纯度鉴定。

1.2.4数据处理与结果分析

数据统计方法参照薛艳等[9]的方法。

SSR纯度(%)=(检测株数-母本带型数-父本带型数)/检测株数×100%。

田间鉴定：试验中所用的材料进行正常管理，根据成熟期的田间表现进行调查，田间鉴定纯度(%)=(检测株数-父本株数-母本株数)/检测株数×100%。

2 结果与分析

2.1 引物筛选结果

根据萝卜基因组信息，设计了20对SSR引物在七星萝卜亲本及F1代间进行多态性筛选，获得了具有共显性差异标记条带的引物对QX-SSR 1，该标记重复性好，条带清晰，序列如下：

上游引物：5’-ATAATGGAAATCCCTGACCA-3’

下游引物：5’-AGCAAATGAAAGGCAAAACT-3’

用该引物对在七星萝卜杂交种中能同时扩增出133 bp和138 bp两条带，七星母本仅扩增出138 bp的条带，七星父本仅扩增出133 bp的条带。

2.2 杂交种纯度的SSR鉴定

为验证准确性，利用筛选到的引物QX-SSR 1对七星萝卜杂交种的纯度进行鉴定，结果表明杂交种纯度为94%(图1)，与田间鉴定结果94%一致，说明分子标记鉴定结果准确，可以应用于七星萝卜杂交种纯度的快速检测。

2.3 引物特异性验证

为验证筛选获得的引物QX-SSR 1的特异性，收集市场上常见的10个青萝卜商品种，提取商品种的基因组DNA作为模板，用引物QX-SSR 1为特异性引物进行PCR扩增，跑胶检测，发现10个商品种的电泳结果都只有1条特异性条带(图2)，与七星萝卜商品种2条不同条带的结果(图1)完全不同，说明该引物不仅能用于区分七星萝卜杂交种中的假杂种，还能用来区分七星萝卜与其他青萝卜商品种，具有很高的特异性。

图2 引物QX-SSR 1在10个青萝卜商品种中的扩增结果

3 结 论

萝卜田间纯度鉴定一般需要2～3个月的时间，易受种植环境的影响，造成鉴定结果不准确，较长的鉴定周期可能会导致商品种错过最佳销售时期。利用SSR分子标记进行纯度鉴定从播种到获得检测结果只需要1周左右的时间，而且鉴定结果不受环境条件以及人为因素的影响，与田间鉴定相比有简便、快速、准确等显著优势。

本研究利用新开发的引物QX-SSR 1对七星萝卜杂交种的纯度进行鉴定，结果表明，杂交种纯度为94%，与田间鉴定结果94%一致，说明该分子标记鉴定结果准确，而且经多批次检测，均表现稳定，此外该引物不仅能区分出七星青萝卜杂交种中混入的父、母本，还能够区分出七星青萝卜与其他青萝卜商品种，具有很高的应用价值。