影响濒危东北岩高兰种子萌发因素分析

(内蒙古农业大学林学院，呼和浩特 010019)

东北岩高兰(Empetrumnigrumvar.japoncum)为岩高兰科(Empetraceae)岩高兰属常绿匍匐小灌木，全科3属9种，我国有1属1变种，主要分布在我国东北大兴安岭地区海拔775～1 650 m的山顶[1-3]，为国家二级保护植物。东北岩高兰是中生喜酸植物[4]，具有耐寒、耐旱、耐贫瘠、喜光及抗风等特性[5]。单性花或两性花，雌雄异株或同株，花期6—7月[6]。浆果状核果，具6～8核，果期7—8月[7]。东北岩高兰的研究以化学成分、药用价值、指示作用为主。全株可入药，具补脾、健胃、助消化、抗疲劳、提高免疫力功效[8]，果滋阴、养肝、明目、利尿，抗维生素C缺乏病[9]，是亚高山矮曲林带的特小灌木之一，具有指示作用[10]。由于东北岩高兰具有很高的药用价值，民间采集比较常见，但不规范采集方式导致东北岩高兰资源急剧减少，也是其被列入国家二级保护植物的主要原因。自然条件下东北岩高兰以克隆繁殖为主，但由于枝条很细，人工用1年生带踵插穗扦插成活率仅为39.1%～40.9%，移栽成活率仅为25.0%～30.4%[10]。满归林业局天然东北岩高兰群落的结实量较多，采用种子繁殖扩大其种群数量，不仅对保护现有资源具有重要作用，也是一种相对可行的有效途径，但对其种子发芽能力的研究仅见种子催芽方法专利[11]，对种子发芽困难的原因还需进一步研讨，如种皮、胚根生长等因素对发芽的影响。本文以东北岩高兰种子为试材，研究种子发芽需要的温度、光照条件，水浸、浓硫酸、激素、低温层积等多种方法催芽后对萌发的影响，未发芽种子种皮和胚的解剖结构特征等，分析导致种子深休眠的原因，种子适宜的萌发条件和幼苗的生长特性，从而为东北岩高兰有性繁殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

种子采自内蒙古自治区大兴安岭北部满归林业局孟库林场和高地林场的东北岩高兰天然群落，具体为分布在落叶松(Larixgmalinii)、樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)、偃松(Pinuspumila)疏林及林缘[12]的东北岩高兰。对采集的果实用水选法进行调制，果实出种率54.51%；单个果实出种4～15个，一般6～9个，并以7个最多；种子净度92.25%，千粒重0.963 g，含水量3.70%。

1.2 研究方法

1.2.1发芽条件选定方法

以浓硫酸处理10 min和1 000 mg/L GA3处理12 h种子为试材，按照1)～3)选择适宜发芽条件：

1) 在光照/黑暗(12 h/12 h)的培养箱内，将温度设置为5，10，15，20，25，30，35 ℃ 7个梯度，选择适宜恒温发芽温度。

2) 在最适恒温条件下，光照时间分为0，6，8，10，12，14 h 6个梯度，选择适宜光照时间。

3) 在最适光照条件下，将每日温度设定为高温+低温各12 h，分别为10 ℃+5 ℃、15 ℃+5 ℃、20 ℃+10 ℃、25 ℃+15 ℃、30 ℃+20 ℃、35 ℃+25 ℃，选择适宜变温发芽条件。

4) 根据实验1)～3)选择温度(25±1)℃、光照/黑暗(12 h/12 h)的适宜发芽条件，在培养箱内对实验1.2.2中的催芽种子进行发芽实验。

1.2.2种子催芽处理方法

1) 用20，40，60，70 ℃的水，并与种子按3∶1体积比例，浸种6 h使种子充分吸水后[13]，进行发芽实验。

2) 将蛭石加水至田间持水量的60%，并与种子按3∶1体积比例混合，放在4 ℃左右的冰箱冷藏室内，低温层积催芽30，50，70，90 d后，进行发芽实验。

3) 用500，700，1 000，1 500 mg/L GA3浸泡种子12 h，使之充分吸收GA3溶液后，进行发芽实验。

4) 采用浓硫酸浸泡种子1，5，10，15，20，30 min，清洗氧化种皮和残留硫酸后，进行发芽实验。

5) 选择浓硫酸处理的阴干种子，用500，700，1 000，1 500 mg/L GA3浸泡12 h后，进行发芽实验。

1.2.3种子发芽指标计算

各发芽实验每100粒种子为1组，重复4次。置床后第2天开始，每天20：00时观察种子发芽数，根长≥种子纵径长度为正常发芽，连续7 d发芽粒数不足供试种子总数1%时发芽实验结束。

发芽率(%)=(n/N)×100%(式中，n为测定时间内正常发芽种子粒数，N为置床时的种子数)[14]；

绝对发芽率(%)=n/(N-No)×100%(式中，n为测定时间内正常发芽种子粒数，N为置床时的种子数，No为发芽结束时未发芽种子空粒数)；

发芽指数=∑Gt/Dt(式中，Gt为在时间t天的发芽数，Dt为相对的发芽天数)[15]；

发芽启动速度=t(式中，t为置床后到第1粒种子萌发所需的天数)。

1.2.4种子解剖方法

为判断种皮和胚对种子萌发的影响，在体视显微镜下，对未发芽的种子，测量其纵径、横径、厚度；再将种子纵向切开，观测种皮的质地、不同部位的厚度、种脐处种皮的厚度，胚和胚乳发育情况，胚根生长情况等。

2 结果与分析

2.1 温度和光照对种子萌发的影响

光照/黑暗(12 h/12 h)的不同恒温发芽实验表明，种子萌发的温度在15～35 ℃之间，以25 ℃的发芽率最高，为19.75%；恒温25 ℃的不同光照时间发芽实验表明，以光照/黑暗(12 h/12 h)的发芽率最高，为19.75%；光照/黑暗(12 h/12 h)的不同变温发芽实验表明，以35 ℃+25 ℃的发芽率最高，为10.50%。综合上述3个实验，发芽率为恒温>变温、有光照>无光照，有光照(见图1)比无光照(见图2)幼苗生长健壮，但无光照幼苗高生长量为有光照幼苗的3～4倍。

2.2 水浸、低温层积、GA3处理对种子萌发的影响

采用不同温度的水浸种，或不同天数低温层积催芽，或GA3浓度为500，700，1 000，1 500 mg/L处理种子，置床后2个月均未见种子萌发。水浸主要是软化种皮，增加透水透气性；低温层积催芽是近自然的催芽方法，一般具备催芽的各种作用；GA3处理则是人工补充外援激素，以改善生长抑制剂和生长促进剂之间的平衡，调节种子的生理代谢。东北岩高兰种子在水浸、低温层积、GA3处理未发，可能与种子的种皮、胚等特征有关。

图1 光照条件下种子萌发图

图2 无光照条件下种子萌发图

2.3 未萌发种子解剖特征

由图3可看出，未萌发种子的纵径、横径、厚度分别为1.61，1.05，0.82 mm；种皮骨质，厚薄不均，厚度在0.15～0.49 mm之间，种脐处皮厚0.21 mm，较薄处在种子上部；种仁纵径、横径、厚度分别为1.00，0.26，0.22 mm；胚和胚乳发育完整，且种子吸水良好，根尖越过种脐，在种仁外侧和种皮内侧生长，未从种脐长出的根长度70.09 mm，为种子纵径长度的43.53%，为种仁纵径长度的70.09%；种子吸水良好，种胚发育饱满，未见空瘪粒，置床2个月也未见腐烂种子。从种子解剖结构分析，种子能够正常吸水，胚能生长，不存在胚发育不全的现象，种皮机械阻力可能是胚不能萌发的主要原因之一。

2.4 切磨种皮对种子萌发的影响

种子用温水浸泡后，采用刀切或砂纸磨的方法破坏种皮，能使种子在置床的第7天开始萌发，发芽率和绝对发芽率均为17.00%，芽的颜色为暗红色。但随着萌发“芽”的生长出现2种情况，有13个百分点的“芽”的颜色一直为暗红色，有4个百分点的“芽”先端变为翠绿色。

由图4可看出，在体视镜下观察种子2种不同的“芽”，是切磨种皮的部位不同，使种子从切磨口处萌发的“芽”也不一样。当切磨掉种脐部位的种皮时，种子萌发暗红色的根芽，15 d左右根芽还会长出多条侧根，在只补充水的情况下，培养40 d依然正常生长，移栽可成活，具较强的耐瘠薄特性；当切磨掉顶部的种皮时，种子萌发暗红色的茎芽，4～5 d茎芽顶端长出翠绿色的子叶，但生长10 d左右出现腐烂现象。

图3 未发芽种子纵切面

图4 不同切磨部位萌发图

2.5 浓硫酸处理对种子萌发的影响

表1表明，不同处理时长对种子萌发影响不同，随着处理时间的延长。发芽率由0.00%逐渐升高到处理10 mim的16.00%，之后随着处理时间增加逐渐降低到0.00%；绝对发芽率和发芽指数变化趋势与发芽率的类似；而萌发启动速变化趋势与此相反。浓硫酸处理时间短，对种皮氧化程度低，不能消除种皮对胚萌发的机械阻力；相反，处理时间过长，则氧化作用透过或完全破坏种皮作用到胚乳和胚，降低了胚的活性，且这种负面影响超过减轻种皮机械阻碍的作用，降低了种子的发芽能力。比较而言，用浓硫酸处理10 mim的种子发芽率最高。

2.6 浓硫酸与GA3组合处理对种子萌发的影响

表2表明，用浓硫酸处理阴干后再用不同浓度GA3处理东北岩高兰种子，随GA3浓度增加种子发芽率依次为9%、12%、19.75%、9%。GA3浓度≤1 000 mg/L时，种子的发芽率随浓度提高而增加；但达到1 500 mg/L时则降低。发芽指数的变化趋势与发芽率相同，萌发启动速度则随着GA3浓度的增加而增加。胚深度休眠是因为体内的生长抑制剂ABA浓度过高，GA3、CTK、IAA等激素浓度相对变低[16]。浓硫酸处理降低了东北岩高兰种皮造成生理休眠的程度，增加GA3则提高了促进种子萌发激素的浓度，逐渐达到了种子体内生长抑制剂与萌发激素的平衡，使种子发芽率逐渐提高；当GA3浓度提高到1 500 mg/L则出现萌发激素过剩导致的不平衡，种子发芽率降低。

表1 浓硫酸处理对种子萌发的影响

处理编号H2SO4浓度(%)H2SO4处理时间(min)发芽率(%)绝对发芽率(%)发芽指数萌发启动速度(d)19810.00bcde0.00bcde0.00bcde0bcde29854.00acdf4.00acdf1.48acdef36acdef3981016.00abdef16.00abdef3.03abdef28abdef4981510.00abcef10.00abcef2.23abcef31abcef598203.00acdef3.00acdef1.27abcdf33abcdf698300.00bcde0.00bcde0.00bcde0bcde

注：表中不同小写字母表示在0.05水平上的显著相关。下同。

表2 浓硫酸与GA3组合处理对种子萌发的影响

处理编号H2SO4浓度(%)H2SO4处理时间(min)GA3浓度(mg/L)GA3处理时间(h)发芽率*(%)绝对发芽率*(%)发芽指数*萌发启动速度*(d)19810500129.00bc9.00bc1.54cd15cd298107001211.00acd11.00acd1.77cd15cd3981010001219.75abd19.75abd3.69abd17abd498101500129.00bc9.00bc2.05abc19abc

采用浓硫酸处理10 min和1 000 mg/L GA3处理12 h的种子发芽率比浓硫酸处理10 min的种子发芽率高3.75个百分点，是本实验最好的催芽方法。

3 讨论与结论

种子的休眠是植物经过长期进化和演变获得一种对不利环境及季节变化的生物学适应性[17]，温度、水分、通气和光照是种子萌发充分的必须条件，光照是部分种子萌发的必要条件。东北岩高兰需要较高萌芽初始温度和适宜的光照才正常萌发和生长，温度过低或过高都会影响种子萌发，表现为萌发缓慢甚至不发芽，前者可能与较低温度导致种子体内酶活性降低和新陈代谢减弱有关，后者可能与高温导致种子体内酶死亡有关[18]；光照则是种子中的光敏色素通过光的作用发生一系列生理生化反应，激发种子萌发，促进幼苗生长[19-20]。

赤霉素是一类植物常用的生长调节剂的总称，用GA3处理种子可增加生长素的含量，促进细胞生长，加快储藏物的转化，促进种子萌发[21]。通常适量GA3处理种子可使新陈代谢强度改变[22]和加速萌发[23-24]，但高浓度的GA3溶液浸种也可抑制种子萌发，用GA3溶液浸种云南松[25-26]、沙冬青[27]、蓝靛果忍冬[18]、樱桃[28]、秀雅杜鹃[29]、欧洲百里香[30]种子，均有这种促进或抑制萌发的现象。东北岩高兰与上述种子不尽相同，在未进行种皮处理前，只用GA3处理种子并没有起到催芽的作用，这可能与东北岩高兰生长在高寒贫瘠、高太阳辐射的恶劣生境下，逐渐与环境协同进化出现了与这种环境相适应的比较复杂的生理休眠特性有关，需要不同催芽方法组合进行处理，才能达到催芽效果，当浓硫酸氧化种皮后骨质厚实的种皮变薄，机械阻力变小，GA3处理种子才起到了一定的催芽效果。这与杜鹃花种子需要GA3分别与超声波、高温层积、机械磨擦等双重方法对种子进行处理才能更有效地打破休眠促进萌发[16]的结果类似，这种种子形态和萌发特性是植物长期适应环境的表现[31]。GA3是控制种子萌发的主要激素，可促进种子完成生理后熟，打破休眠[32]，但对于东北岩高兰种子并未起到明显促进萌发的作用。

东北岩高兰种子休眠属于生理休眠，种皮骨质厚实、种胚较小且萌发后推动力不足，种脐相对密闭影响胚根伸出，均是种子休眠的主要原因。在种皮不做处理的情况下，单一的20～70 ℃水浸、低温层积30～90 d、500～1 500 mg/L GA3处理均不能萌发，切磨种皮或适当时间的浓硫酸浸泡能够促进种子萌发，且浓硫酸和1 000 mg/L GA3分别浸泡10 min和12 h的种子萌发率最大；正常萌发的幼苗具有较强的耐瘠薄性，仅维持水分供应可长出多条侧根，并能移栽成活；种子在气温15～35 ℃之间萌发，25 ℃、12 h光照是最适的萌发温光条件。