HPLC法测定壶瓶枣中环磷酸腺苷含量的研究

苗潋涓，侯艳霞，郝瑞芳，宿炳林，卢桂宾，白 斌

(山西林业职业技术学院，山西 太原 030009)

壶瓶枣是山西省太谷县特产，药食同源植物，中国国家地理标志产品。据报道，环磷酸腺苷(cAMP)在枣中的含量是现在所有已测动植物材料中最高的。环磷酸腺苷(cAMP)具有缓解抑郁症、消化功能障碍，调节肝功能，放松平滑肌、扩张血管，激活蛋白等作用。常用的cAMP检测方法有蛋白免疫结合法、高效液相色谱法、紫外分光光度法、薄层色谱法等。本试验以壶瓶枣为研究对象，采用酶解浸提法，提高壶瓶枣中cAMP的提取量，建立了检测壶瓶枣中cAMP含量的高效液相色谱法。该方法快捷准确，可为以后研究不同时期cAMP含量变化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与药品

试验材料为壶瓶枣，采自山西省农科院果树所国家枣种质资源圃。

药品为甲醇(色谱级，4 L，北京迪科马科技有限公司)；纤维素酶(阿拉丁，25 g)；环磷酸腺苷标准品(cAMP，纯度>99.0%，上海化成工业发展有限公司)；柠檬酸、磷酸二氢钾(分析纯，天津化学试剂三厂)。

1.1.2 试验仪器

高效液相色谱仪(Skyray Instrument)；高速冷冻离心机(eppendorf, centrifuge 5810R)；鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；超纯水机(北京普析通用仪器有限责任公司)；数控超声波清洗器(KQ-500DB型)。

1.2 方法

1.2.1 定量工作曲线

精确称取100 mg cAMP标准品定容至100 mL，配制成1 mg/mL的标准储备液，于4 ℃冷藏保存。分别配制成浓度为10 μg/mL，20 μg/mL，30 μg/mL，40 μg/mL，50 μg/mL的cAMP溶液，制作标准曲线。

1.2.2 样品预处理

选取大小均匀的壶瓶枣清洗干净，切成细条，放入55 ℃烘箱中烘干，然后粉碎过50目筛，制备成干枣粉样品。准确称取1.000 0 g枣粉，用热水溶解，在60 ℃温水浴中浸提1 h，取出后冷却至室温，用0.1 mol/L柠檬酸调节pH至5.0.按照1∶100的质量比加入纤维素酶，于45 ℃水浴45 min，然后超声波浸提20 min，取出后定容至50 mL离心管。设置温度4 ℃，转速4 000 r/min，离心10 min，用 2 mL注射器吸取样液过0.45 μm有机系滤膜，打入进样瓶待测。

1.2.3 色谱条件

采用Sino Chrom ODS-BP色谱柱(5 μm，4.6 mm×200.0 mm)，柱温为30 ℃，流动相为磷酸二氢钾溶液-甲醇(80 ∶20，过0.45 μm 有机系滤膜，超声脱气)，流速为1 mL/min.进样量为10 μL，检测波长为259 nm.

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

环磷酸腺苷易溶于甲醇-磷酸二氢钾溶液或甲醇-水溶液，因此，本试验选择这2种混合溶液分别作为流动相进行对比研究。结果表明，甲醇-磷酸二氢钾溶液洗脱固定相上吸附的化合物效果更好，而且相近保留时间的组分液不容易分开。进一步优化流动相比例，分别比较甲醇-磷酸二氢钾溶液(10 ∶90)、甲醇-磷酸二氢钾溶液(20 ∶80)、甲醇-磷酸二氢钾溶液(30 ∶70)，结果表明，甲醇-磷酸二氢钾溶液(20 ∶80)待测组分分离效果好，分析时间为5 min左右，符合快速检测要求。环磷酸腺苷标准品谱图见图1.

2.2 标准曲线的制作

用超纯水稀释1 mg/mL的标准储备液，分别配制成10 μg/mL，20 μg/mL，30 μg/mL，40 μg/mL，50 μg/mL 浓度溶液，以检测峰面积为横坐标，浓度为纵坐标绘制标准曲线，结果见图 2.

图1 环磷酸腺苷标准品HPLC谱图

图2 环磷酸腺苷标准曲线

环磷酸腺苷在10.0 μg/mL～50.0 μg/mL浓度范围内，浓度和检测峰面积呈良好的线性关系，线性方程为y=0.000 320 10x，相关系数为 0.999 076 28.

2.3 实际样品的测定

用本试验建立的方法测定山西太谷壶瓶枣样品20份，检测出环磷酸腺苷含量在129.92 μg/g～474.19 μg/g之间。

3 结论

本试验建立了壶瓶枣中环磷酸腺苷测定的高效液相色谱法。这种方法具有操作简单，重复性好，选择性好，专一性强等优势。同时，对提取方法的优化也提高了环磷酸腺苷的提取量，可为后续研究不同品种、不同时期枣中环磷酸腺苷含量的变化提供方法基础。