苯磺顺阿曲库铵注射液细菌内毒素检查法研究

陈青连，姚 振，冯 雅

（杭州澳亚生物技术有限公司，浙江 杭州 310018）

苯磺顺阿曲库铵为神经肌肉阻滞剂，可在运动终板上与胆碱能受体结合，拮抗乙酰胆碱，从而产生竞争性的神经肌肉传导阻滞作用。本品由GaxoWellcome公司（葛兰素）于1996年首次在英国上市，商品名为赛机宁（Nimbex）。根据《注射剂安全性检查法应用指导原则》，静脉用注射剂均应设立细菌内毒素（或热原）检查项［1］，该品种及其注射剂已收载于2015年版《中国药典（四部）》。国内常采用凝胶法对注射用苯磺顺阿曲库铵进行细菌内毒素检查研究，国际通行光度法，而我国凝胶法使用较普遍，且2015年版《中国药典》也以凝胶法结果为准［2］。本研究中采用凝胶法对苯磺顺阿曲库铵注射液进行了细菌内毒素方法学研究。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

XH-D型涡旋混合器（上海允延仪器有限公司）；N10型试管恒温仪（杭州奥盛仪器有限公司）。

1.2 试药

苯磺顺阿曲库铵（TEVA，批号为4014AO00117R，规 格 为 原 料 ）；苯 磺 酸 （Sigma-Aldrich，批 号 为BCBR4713V，规格为辅料）；苯磺顺阿曲库铵注射液（杭州澳亚生物技术有限公司，批号为分别17121311，17121411，17121511，规格为每支 5 mL ∶10 mg）。细菌内毒素工作标准品（WSE，湛江安度斯生物有限公司，批号为 1708160，规格为 10 EU）；鲎试剂（TAL；批号分别为1607291 和 1704072、灵敏度为 0.25 EU ／mL，批号分别为 1705243 和 1612283、灵敏度为 0.125 EU ／mL，批号为1712252、灵敏度为0.06 EU／mL，湛江安度斯生物有限公司；批号为 17031712、灵敏度为 0.25 EU ／mL，批号为 17060412、灵 敏 度 为 0.125 EU／mL，批 号 为17070112，灵敏度为 0.06 EU ／mL；福州新北生化工业有限公司）；细菌内毒素检查用水（WBET，批号为1608010，规格为 5 mL），稀释剂Ⅰ（BufferⅠ，批号为1702210，规格为4.0 mL），均购于湛江安度斯生物有限公司。

2 方法与结果

2.1 预试验

苯磺顺阿曲库铵注射液由苯磺顺阿曲库铵、苯磺酸、注射用水组成。为苯磺顺阿曲库铵注射液细菌内毒素检查鲎试剂灵敏度的选择提供参考，分别采用不同厂家灵敏度为0.25 EU／mL的鲎试剂对苯磺顺阿曲库铵及苯磺酸进行细菌内毒素检查，其中苯磺顺阿曲库铵细菌内毒素限值参考原料厂家（TEVA）为4.94 EU／mg，苯磺酸细菌内毒素限值暂定为10 EU／mg。采用不同厂家灵敏度为0.25 EU／mL的鲎试剂对苯磺酸细菌内毒素进行检查，结果均符合规定；采用湛江安度斯生物有限公司0.25 EU／mL的鲎试剂对苯磺顺阿曲库铵细菌内毒素进行检查，供试品阳性对照平行管均呈阴性，结果不符合规定。改用灵敏度为0.125 EU／mL的鲎试剂进行检查，试验结果均符合规定。

根据细菌内毒素验证方法学指导原则，注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查方法时，为验证不同样品和不同鲎试剂反应的一致性，要求同时使用2个厂家的鲎试剂对每个品种至少3批样品进行干扰试验，以确定该品种是否对内毒素和鲎试剂的反应存在干扰作用，以及能否使用内毒素检查法进行检验。综合考虑，拟采用灵敏度为0.125 EU／mL的鲎试剂对苯磺顺阿曲库铵注射液进行细菌内毒素干扰试验。

2.2 鲎试剂灵敏度复核试验Ⅰ

根据2015年版《中国药典（四部）》相关规定，当使用新批号的鲎试剂时，应进行鲎试剂的灵敏度复核试验。用 WBET 将 WSE 稀释成 2.0，1.0，0.5，0.25 λ 系列浓度后进行试验。结果表明，所用各批鲎试剂的复核灵敏度（λC）为 0.5 ～ 2.0 λ，可用于细菌内毒素检查。详见表1。

表1 鲎试剂灵敏度复核试验结果Ⅰ

2.3 细菌内毒素限值（L）的确定

公式为L＝K／M，其中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU／mg表示；K为人每1 kg体质量每1 h最大可接受的内毒素剂量，以EU／（kg·h）表示，注射剂K＝5EU／（kg·h）；M为人用每1 kg体质量每1 h的最大供试品剂量，以mg／（kg·h）表示。根据苯磺顺阿曲库铵注射液原研药品说明书中的用法用量“按静脉输注给药，2 g／L 的顺阿曲库铵最大剂量为 9.0 μg ／（kg·min），即0.54 mg ／（kg·h）。”计算确定L＝9.26 EU ／mg。为保证药品质量及用药安全，应不高于临床用药计算的最大限制（9.26 EU／mg），故确定苯磺顺阿曲库铵注射液L值与2015年版《中国药典（二部）》注射用苯磺顺阿曲库铵质量标准中细菌内毒素的限值一致，即为3.0 EU／mg。

2.4 干扰预试验Ⅰ

供试品最小有效稀释浓度计算：根据L值确定最小有效稀释浓度（C）公式为C＝λ／L。其中，C为最小有效稀释浓度；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度。本验证方案拟采用标示灵敏度为0.125 EU／mL的鲎试剂，L为 3.0 EU ／mg，C＝ λ ／L＝0.042 g／L。

试验方法：将供试品用WBET稀释至质量浓度为0.680，0.340，0.170，0.085，0.042 g／L，此系列质量浓度溶液记为NPC。同时在上述试验液中加入细菌内毒素标准溶液，使每个质量浓度的试验液中均含2 λ浓度的细菌内毒素，此系列溶液记为PPC。取2.2项下2个厂家灵敏度为0.125 EU／mL的鲎试剂各64支，分别与上述2个系列溶液反应，每个浓度重复2管。每批鲎试剂作阴性对照（NC）和阳性对照（PC）。干扰预试验Ⅰ结果见表2。可见，苯磺顺阿曲库铵注射液质量浓度为0.042 g／L时，对2个厂家的鲎试剂均无干扰作用，因此，正式干扰试验时，采用供试品质量浓度为0.042 g／L的溶液。

表2 干扰预试验Ⅰ结果

2.5 正式干扰试验Ⅰ

结果见表3。可见，WBET配制的内毒素溶液反应终点浓度的几何平均值（Es）在 0.5 ～ 2.0 λ（包括 0.5 λ和 2.0 λ）时，0.042 g／L 的供试品溶液 3 批供试品的Et值均不在 0.5 ～ 2.0Es（包括 0.5Es 和 2.0Es）范围内，表明供试品在此质量浓度下有较强的干扰作用。当供试品对鲎试剂凝胶形成有影响时，为减少假阴性结果，可采用灵敏度小于 0.125 EU ／mL 的鲎试剂［3］。

表3 正式干扰试验Ⅰ结果

2.6 鲎试剂灵敏度复核试验Ⅱ

对标示灵敏度为0.06 EU／mL的鲎试剂进行复核，结果表明所用各批鲎试剂的复核灵敏度λC均为0.5～2.0 λ，可用于细菌内毒素检查。详见表4。

表4 鲎试剂灵敏度复核试验结果Ⅱ

2.7 干扰预试验Ⅱ

采用标示灵敏度为0.06 EU／mL的鲎试剂，最小有效稀释质量浓度C＝0.02 g／L。将供试品用WBET稀释至质量浓度为 0.32，0.16，0.08，0.04，0.02 g／L，同2.4项下方法操作，取2.2项下2个厂家灵敏度为0.06 EU／mL的鲎试剂各64支，分别与上述2个系列溶液反应，每个浓度重复2管，每批鲎试剂作NC和PC。干扰预试验结果符合标准规定。采用灵敏度0.06 EU／mL的鲎试剂对苯磺顺阿曲库铵注射液进行细菌内毒素方法学验证，干扰预试验结果表明，供试品对鲎试剂与内毒素的反应有较强的抑制作用。补充适量的二价离子可有效消除苯磺顺阿曲库铵对细菌内毒素检查的抑制作用［4］。采用稀释剂Ⅰ替代WBET制备供试品，预试验结果符合标准规定。

2.8 干扰预试验Ⅲ

以稀释剂Ⅰ替代WBET制备供试品，按2.6项下方法对供试品进行梯度稀释，采用灵敏度为0.06 EU／mL的鲎试剂对3批苯磺顺阿曲库铵注射液进行干扰预试验，结果见表5。可见，供试品溶液质量浓度为0.02 g／L时对2个厂家的鲎试剂均无干扰。

2.9 正式干扰试验Ⅱ

结果见表 6。可见，Es在 0.5 ～2.0 λ（包括 0.5 λ 和2.0 λ）时，质量浓度为 0.02 g／L 的供试品溶液 3 批供试品的Et值在 0.5 ～2.0Es（包括 0.5Es和 2.0Es）范围内，确认供试品在此浓度下无干扰作用。

2.10 供试品检验

取3批供试品各1瓶，用稀释剂Ⅰ按上述方法分别配制成质量浓度为0.02 g／L的供试品溶液，以灵敏度为0.06 EU／mL的鲎试剂依法检查。结果见表7。

表5 干扰预试验Ⅲ结果

表6 正式干扰试验Ⅱ结果

表7 供试品检验结果

3 讨论

2015年版《中国药典》热原物质检查有家兔检查法与细菌内毒素检查法［5-6］，前者试验灵敏度低、周期长、重复性差、检测成本高。与家兔检查法相比，细菌内毒素检查法具有检测灵敏度高、重复性好、检测成本低、结果准确等优点［7-8］。用细菌内毒素检查法代替热原法也符合动物试验学的3R原则，故今后会得到广泛应用［9］。

目前，细菌内毒素检查法使用较多的是凝胶限度法与动态浊度法。凝胶限度法无法对细菌内毒素进行定量，仅根据是否超过限值作出判断。动态浊度法可通过反应曲线来获得细菌内毒素的量。随着国内外药品质量及安全性的提高，内毒素定量检测是大势所趋［10-11］。

苯磺顺阿曲库铵注射液的细菌内毒素理论限值为9.26 EU／mg，《化学药品注射剂安全性检查法应用指导原则》要求限值可适当严格至理论限值的 1 ／3 ～1 ／2［12］，参考2015年版《中国药典》注射用苯磺顺阿曲库铵质量标准“每1 mg顺阿曲库铵含内毒素的量应小于3.0 EU”，因此采用内毒素限值L为3.0EU／mg进行研究。2015年版《中国药典》要求供试品pH为6.0～8.0。且有学者认为，鲎试剂对供试品有一定的缓冲能力［13］。苯磺顺阿曲库铵注射液的pH为3.0～3.8，经WBET稀释后，pH约为6.0，故本试验无须使用辅助试剂（如稀释剂Ⅱ）对供试品pH进行调节。

稀释剂Ⅰ是一种辅助剂，含有一定浓度的二价离子，可饱和枸橼酸盐的螯合反应，维持鲎试剂的正常灵敏度，并有较强的pH缓冲能力，使反应介质保持反应所需的最佳pH。有研究中使用稀释剂Ⅰ制备供试品溶液，有效地消除了其对鲎试剂与内毒素的抑制作用［14-15］。在以WBET制备苯磺顺阿曲库铵注射液供试品溶液时，正式干扰试验结果表明，苯磺顺阿曲库铵对鲎试剂与内毒素的凝集反应有较强的抑制作用。由表5可见，以稀释剂Ⅰ代替 WBET，供试品溶液在 0.02 g／L时对2个厂家的鲎试剂均无干扰作用。正式干扰试验用0.02 g／L供试品稀释液及2个厂家的鲎试剂，结果Es均为 0.5 ～ 2.0 λ（包括 0.5 λ 和 2.0 λ），Et为 0.5 ～ 2.0Es（包括 0.5Es和 2.0Es），说明苯磺顺阿曲库铵注射液在该浓度下无干扰作用。因此，可用凝胶法对苯磺顺阿曲库铵注射液进行细菌内毒素检查。