白藜芦醇对化疗所致大鼠卵巢损伤的保护作用

朱小丹 董若曦 陈 燕 吴晓慧 姚馨怡 许文娟 樊伯珍

早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)指女性在40岁之前卵巢功能衰退的临床综合征，以月经紊乱(如停经或稀发月经)伴有高促性腺激素和低雌激素为特征，是一种较为严重的威胁生殖健康的疾病。近年来，随着化学治疗药物的广泛使用，化疗导致的卵巢损伤成为POI的重要病因。目前对于化疗性卵巢损伤的保护，所探索的各种药物和方法均存在一定的局限性。白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种存在于葡萄、花生根茎和多种药用植物中的1,2-二苯乙烯化合物多酚，有较强大的抗氧化功能，能阻止血小板凝聚、防止人体低密度脂蛋白氧化、清除自由基，并能改善修复卵母细胞损伤，改善卵母细胞质量，减轻氧化损伤所致老化和与年龄相关的疾病[1]。本研究旨在探讨白藜芦醇预防性应用对化疗后卵巢组织结构、各级卵泡数量、内分泌功能所起的一系列作用，为临床肿瘤治疗和免疫性疾病中应用大剂量的化疗药物时所导致的卵巢损伤，提供有效的保护方法和科学依据。

材料与方法

1.实验动物:近交系雌性Wistar大白鼠，8周龄。体质量180～200g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于上海中医药大学附属普陀医院中心实验室动物房。喂食无特殊病原体(SPF)级鼠饲料及净化水，室温20～25℃，相对湿度45%～55%。每日光照12h，饲养1周熟悉环境后，每日清晨9:00行阴道涂片，显微镜下观察动情周期，选用有正常动情周期的40只大鼠进入实验。

2.实验试剂：顺铂冻干粉购自山东齐鲁制药有限公司；白藜芦醇购自上海祥弘生物科技有限公司；酶联免疫法E2、FSH、AMH试剂盒均购自美国贝克曼库尔特有限公司。

3.实验分组及处理：40只雌性Wistar大鼠采用数字表法随机分成4组，即对照组、腹腔化疗组(CP模型组)、低剂量白藜芦醇+腹腔化疗组(低Res组)、高剂量白藜芦醇+腹腔化疗组(高Res组)，每组10只大鼠。在21天的实验期间，对照组不给于任何药物处理，CP模型组给予生理盐水1ml/d灌胃，低Res组、高Res组则分别给予白藜芦醇25mg/(kg·d)、75mg/(kg·d)溶于生理盐水1ml中灌胃。在实验第15天，除对照组外，其余3组大鼠均称质量后，单次给予顺铂(5mg/kg)，用生理盐水稀释至2ml，注射入腹腔内。

4.标本提取及检测：实验第21天，即顺铂腹腔注射后1周，各组大鼠完成全部给药后24h，对所有大鼠进行麻醉。取腹主动脉血，于室温下静置2h后，3000r/min离心15min。按照酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒说明书进行操作，测定血清E2、FSH、AMH浓度。处死各组大鼠，取出双侧卵巢称。卵巢组织脱水后，10%甲醛固定24h，经过常规石蜡包埋。连续切片厚度5μm，每隔9张即取第10张切片，用苏木精和伊红染色。在400倍光学显微镜下观察卵泡发育，进行各级卵泡计数:原始卵泡、生长卵泡(初级泡数+次级卵泡)、成熟卵泡数量。

结 果

1.各组大鼠血清激素水平的变化:各组大鼠血清中E2和FSH浓度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，CP模型组大鼠血清AMH浓度降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与CP模型组比较，白藜芦醇高、低剂量给药组大鼠血清AMH浓度增高，差异有统计学意义(P<0.05)；而低Res组和高Res组比较，血清AMH浓度差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1。

表1 各组大鼠血清E2、FSH、AMH浓度

与对照组比较，*P<0.05;与CP模型组比较，#P<0.05

2.各组大鼠卵巢湿质量的变化：取材后称量大鼠卵巢湿质量，与对照组比较，CP模型组大鼠卵巢湿质量减轻，差异有统计学意义(P<0.05)；与CP模型组比较，高Res组、低Res组大鼠卵巢湿质量增加，差异有统计学意义(P<0.05)，而高Res组、低Res组比较，大鼠卵巢湿质量差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组大鼠卵巢湿质量

与对照组比较，*P<0.05;与CP模型组比较，#P<0.05

3.各组大鼠卵泡数目的变化:与对照组比较，CP模型组大鼠原始、生长、成熟卵泡的数量均明显减少(P<0.05)。与CP模型组比较，白藜芦醇高、低剂量给药组各级卵泡数均明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，低Res组与高Res组比较，各级卵泡数量增多，差异无统计学意义(P>0.05)，详见图1、表3。

讨 论

本研究发现，通过白藜芦醇的治疗，大鼠血清AMH表达水平的升高差异有统计学意义。组织学检查显示，白藜芦醇能通过保护原始、生长和成熟卵泡，来减少顺铂诱导的卵巢损伤。

图1 各组大鼠卵巢中的各期卵泡(HE，×200)A.对照组；B.CP模型组；C.低Res组；E.高Res组。原始卵泡；生长卵泡；成熟卵泡

表3 各组大鼠卵巢内各期卵泡数

与对照组比较，*P<0.05；与CP模型组比较，#P<0.05

近年来，随着化疗药物和靶向治疗的进展，肿瘤和免疫性疾病的缓解和治愈率正在稳步提高。但化疗可能导致卵巢储备下降，甚至完全性卵巢功能衰竭。顺铂是一种广泛应用的化疗药物，用于治疗大多数类型的癌症。研究发现，顺铂可促使人卵巢颗粒细胞的凋亡和原始卵泡的破坏，可导致以卵泡细胞凋亡增加、AMH分泌减少、动情周期紊乱等为特征的卵巢衰竭[2，3]。在化疗引起的卵巢损伤中，可通过测定激素如促卵泡激素(FSH)，雌二醇(E2)，抑制素B(inhibit B)和抗苗勒试管激素(AMH)的血浆水平来评估药物的保护作用[4]。

AMH是一种由小发育卵泡产生的二聚体蛋白质，血浆AMH水平不随月经周期而改变。随着女性年龄的增长，AMH水平下降，与卵巢储备能力呈正相关。相比其他激素，这是一个更为敏感的卵巢储备指标[5]。Yeh等[6]评估血清AMH和FSH水平、卵巢AMH的表达和卵泡的形态(一级、二级和窦卵泡)作为生物标志物在顺铂诱导卵巢损伤中的变化，结果表明AMH在血清及卵巢组织中的表达呈顺铂剂量依赖式降低，这种减少的基本机制和卵泡凋亡的增加有关。Erba等[7]研究了催产素对顺铂损伤的卵巢组织的治疗作用，确定了顺铂导致大鼠血清AMH水平显著降低。所以，血清AMH水平可作为顺铂诱导卵巢损伤的生物标志物。

本研究发现，腹腔注射顺铂5mg/kg可显著减少原始、初级和次级卵泡的数目，降低血清AMH的水平，证实了顺铂化疗对卵泡细胞有毒性作用。Erba等[7]在顺铂治疗大鼠中也发现了原始卵泡数目明显下降，并在组织病理学评估卵泡，发现顺铂治疗损伤大多数卵泡颗粒层，降低卵泡的完整性，与本研究结果一致。但本研究中各组大鼠E2和FSH的监测未发现差异有统计学意义，这可能和大鼠的动情周期，以及E2、FSH的脉冲释放有关。

白藜芦醇是一种多酚类，非类黄酮类抗氧化剂。它是在葡萄皮和高剂量红葡萄酒中发现的植物抗毒素[8]。它具有抗炎、抗氧化和免疫调节功能，通过上调细胞中的抗氧化系统发挥抗氧化功能，也对自由基具有直接的破坏作用[9]。Rubiolo等[10]研究发现，通过用25mg、50mg和75mg剂量的白藜芦醇可活化抗氧化酶活性，保护受氧化应激损伤的原代培养的大鼠肝细胞免受氧化损伤，50mg组的保护效应最显著。Liu等[11]在一项白藜芦醇对大鼠年龄相关不孕症的影响的研究中，将白藜芦醇30mg/L[约7mg/(kg·d)]加入饮用水中6和12个月，并在白藜芦醇和对照组中评估卵巢功能和生育力，结果表明，白藜芦醇能保护免受年龄相关的生育力变化，促进卵母细胞数量和质量的恢复，并保持了健康的卵泡数量。这些研究发现支持白藜芦醇延缓卵巢衰老的假说。

白藜芦醇的这些作用可能与端粒长度和端粒酶活性增加，与生殖细胞功能障碍减少和SIRT1激活有关。Kong等[12]研究了白藜芦醇的作用对不同年龄大鼠卵巢发育的影响，20mg/(kg·d)的白藜芦醇处理显著增加卵母细胞总数，闭锁卵泡数目减少，并抑制了细胞凋亡以及卵泡从原始阶段向其他阶段的转变阶段。Chen等[13]研究了影响中药多酚对衰老大鼠卵巢储备的保护作用，并显示已经用白藜芦醇治疗的老鼠4个月有更健康的卵泡和更少的闭锁卵泡。Atli等[14]研究发现白藜芦醇治疗增加了大鼠发育卵泡，减少闭锁卵泡的数量，并保护卵巢功能抵抗氧化损伤。在本研究中，低Res组给予25mg/kg，高Res组给予75mg/kg白藜芦醇共21天，第15天给予单次剂量5mg/kg 顺铂腹腔内注射。低剂量和高剂量白藜芦醇组的AMH水平均较顺铂模型组显著升高。组织学病理发现低剂量和高剂量白藜芦醇组的原始、生长、成熟卵泡均比顺铂组高。

Simsek等[15]研究了白藜芦醇对全身放射治疗引起的大鼠急性卵巢毒性的疗效，并表明在照射前施用生理剂量白藜芦醇(10mg/kg)的总卵泡数量比对药物剂量(100mg/kg)具有更大的保护作用。这一发现被认为与高剂量白藜芦醇的促凋亡作用有关。Tseng等[16]报道，100mg/kg剂量的白藜芦醇诱导大鼠大脑神经胶质瘤细胞凋亡。同样，Chao等[17]研究发现,白藜芦醇对人垂体瘤GH3细胞具有浓度依赖性双相作用，并且表明在较低剂量(1μmol/L)下，白藜芦醇增加细胞增殖，而在10μmol/L或更高剂量下，诱导细胞凋亡。本研究中低剂量白藜芦醇组各级卵泡数量明显比顺铂模型组较高。但高剂量白藜芦醇组的原始、生长、成熟卵泡数量并没有明显低于低剂量白藜芦醇组，这些结果可以通过白藜芦醇的浓度依赖性双相效应来解释。这项研究表明，适当剂量的白藜芦醇可能通过增加健康卵泡的数量来保护卵巢功能。

本实验研究表明，顺铂腹腔化疗会破坏大鼠卵巢结构，显著降低卵巢原始卵泡、生长卵泡和成熟卵泡的数目，降低血清AMH的浓度水平。而白藜芦醇，特别是低剂量白藜芦醇的预防性使用，能够减轻顺铂对大鼠卵巢组织结构的破坏及其对卵泡生长过程的抑制作用，促进卵泡生长，增加各级卵泡数，增强卵巢的储备能力，其具体的保护机制有待于进一步研究。