结肠腺癌中MGMT和galectin-3的表达及其与淋巴结转移的关系

苏 赓 梁科庆 罗显克 温 伟

结直肠腺癌是胃肠道最常见的恶性肿瘤之一，尽管目前诊断和治疗方面取得一定的进展，但就病死率而言，在引起死亡的癌症中，它仍位居第4位[1，2]。结肠腺癌的患者容易发生转移和复发，传统的临床病理分期不足以确定恶性肿瘤的预后，需寻找一些可靠的分子生物学标志物。 研究表明很多恶性肿瘤的发生、发展及预后与DNA 修复酶O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)和半乳糖凝集素-3(galectin-3，GAL-3)表达异常有关，本研究通过免疫组化(SP)法对51例结肠腺癌患者组织，含其中29例有淋巴结转移组织，同期51例炎性结肠黏膜病变组织中MGMG和galectin-3的表达进行研究，为临床筛选高危人群，判断结肠腺癌、评价预后及靶向治疗提供参考价值[3，4]。

资料与方法

1.一般资料:收集2010年2月～2015年2月广西壮族自治区民族医院51例结肠腺癌患者组织，含其中29例有淋巴结转移组织，同期51例炎性结肠黏膜病变组织进行研究。患者发病30～82岁，中位年龄57岁，所有患者术前均未进行放射治疗或化学治疗。

2.免疫组化检测：MGMT和galectin-3单克隆即用型抗体均购自福州迈新生物技术公司产品，标本经10%甲醛溶液固定，每例标本分别进行两种处理:(1)常规切片HE染色(图1)复查诊断。(2)用于免疫组织化学(免疫组化)染色的标本按如下方法处理。10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片厚3～4μm，贴在预先涂有多聚赖氨酸的干净载玻片上，放入55～60℃恒温箱24h以上，至染色时取出以防止脱片，按常规SP法染色。设立对照：以已知MGMT和galectin-3阳性组织切片作为阳性对照，以PBS液代替一抗作为阴性对照。

3.结果判定：MGMT染色定位于细胞核和(或)细胞质，galectin-3染色定位于细胞质。在光学显微镜下结合HE片观察免疫组化染色结果，结果判定采用双盲法，随机选择10个高倍视野，每个视野计算100个肿瘤细胞，无细胞着色为0分，≥1%且<10%细胞着色为1分，≥10%且<50%细胞着色为2分，≥50%以上细胞着色计3分。染色强度分为：无棕黄色计0分，微弱棕黄色计1分，中等强度棕黄色计2分，褐色或棕褐色计3分。免疫组化结果以阳性细胞计数与着色强度的相乘结果表示MGMT和galectin-3的表达强度，0分判定为(-)，1～3分判定为(+)，4～6分判定为(++)，7～10分判定为(+++)。

4.统计学方法:采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行统计分析，组间数据用χ2检验，相关分析以Spearman等级相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.MGMT和galectin-3在结肠腺癌、炎性肠黏膜病变中的表达：51例结肠腺癌组织中MGMT阳性表达者30例 (阳性率58.82%，图1)，在51例炎性肠黏膜病变中阳性表达40例(阳性率78.43%)，差异有统计学意义(P<0.05)；51例结肠腺癌组织中galectin-3 阳性表达者29例(阳性率56.86%,图2)，在51例炎性肠黏膜病变中阳性表达18例(阳性率35.29%)，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 MGMT和galectin-3在结肠腺癌、炎性肠黏膜病变中的表达

2.MGMT和galectin-3蛋白与结肠腺癌淋巴结转移的关系:MGMT在有淋巴结转移对应的29例结肠腺癌根治术标本组织中，阳性率为44.83%(13/29)，在无淋巴结转移对应的22例结肠腺癌根治术标本组织中，阳性率为77.27%(17/22)，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。MGMT在转移性淋巴结组织中的阳性率(17.24%，5/29)低于有淋巴结转移的结肠腺癌组织(44.83%，13/29，图1)，差异有统计学意义(P<0.05，表3)。 galectin-3在有淋巴结转移对应的29例结肠腺癌根治术标本组织中，阳性率为68.27%(20/29)，在无淋巴结转移对应的22例结肠腺癌根治术标本组织中，阳性率为40.91%(9/22)，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。galectin-3在转移性淋巴结组织中的阳性率(93.10%，27/29)高于有淋巴结转移的结肠腺癌组织(68.97%，20/29,图2)，差异有统计学意义(P<0.05,表3)。

表2 MGMT和galectin-3在有无淋巴结转移的结肠腺癌组织中的阳性率比较

图1 MGMT在结肠腺癌和淋巴结转移癌中的表达(SP,×200)A.结肠腺癌组织;B.淋巴结转移癌组织

图2 galectin-3在结肠腺癌和淋巴结转移癌中的表达(SP,×200)A.结肠腺癌组织;B.淋巴结转移癌组织

表3 MGMT和galectin-3在有淋巴结转移的结肠腺癌及转移淋巴结组织中阳性率的比较

3.MGMT和galectin-3在结肠腺癌中表达之间的相关性分析：应用Spearman等级相关分析MGMT和galectin-3蛋白表达的相关性， 30例MGMT阳性表达的结肠腺癌中，galectin-3表达阴性者17例；21例MGMT阴性表达的结肠腺癌中，galectin-3表达阳性者16例。结果显示MGMT蛋白和galectin-3蛋白表达呈负相关(r=-0.327，P=0.019)。

讨 论

结肠腺癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发生率与多种因素有关。烷化剂是一类重要的致癌物质，它不仅存在于大量的外界环境中，它也可以在身体的代谢过程中产生。MGMT是一种高效DNA直接修复酶,也是目前发现参与此种修复的唯一蛋白。该蛋白能够将受损DNA O6-mG位的烷化基团转移到自身的半胱氨酸残基上,同时自身也因接受了烷化基团而失活，能特异修复DNA序列中的O6-烷基鸟嘌呤损伤，维持基因组精确性和完整性，防止烷基化合物诱导的致癌作用[5，6]。研究结果表明, MGMT 的表达水平在胶质瘤、胃癌、乳腺癌的总体生存率中扮演一个重要的预警指标[7～9]。胃癌组织中MGMT蛋白表达强度与组织学分化程度，浸润和淋巴结转移显著相关。在浸润性乳腺癌患者中，所有患者术后局部复发的MGMT表达阴性。然而，MGMT表达与结肠腺癌的临床病理特征之间的关系仍不清楚。目前大部分研究都集中于结肠腺癌的MGMT 启动子的甲基化状态的激活因素。有研究报道结直肠癌中 MGMT启动子区 CpG岛存在过度甲基化,导致 MGMT表达的缺失不能修复基因损伤，因此引起肿瘤的发生, 这是目前为止最广为接受的结肠腺癌发生机制之一[10，11]。本组实验结果显示，MGMT在结肠腺癌中的阳性率低于炎性肠黏膜病变组织。在结肠腺癌组织中，有淋巴结转移组中MGMT阳性率也低于无淋巴结转移组，差异有统计学意义(P<0．05)。另外，转移淋巴结中MGMT阳性率也明显低于有淋巴结转移的结肠腺癌组织，差异有统计学意义(P<0.05)，本研究提示MGMT的水平与肿瘤所处的发展阶段有一定关系,在肿瘤进展期MGMT的表达下调,在侵袭性肿瘤中达到最低水平。

galectin-3是半乳糖凝集素家族的重要成员，能特异识别并结合半乳糖苷结构，通过介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的黏附促进肿瘤的侵袭转移。galectin-3通过与细胞黏附相关分子结合并抑制细胞-细胞和细胞-基质相互作用来调节转移，从而增加癌细胞脱离和迁移率[12～14]。临床研究表明galectin-3高表达与多种肿瘤的浸润和转移倾向以及患者的预后有关，包括甲状腺乳头状癌和宫颈癌在内的多种实体瘤组织中高度表达[15，16]。尽管galectin-3的细胞外表达调节人结肠癌转移的各个阶段，但其在结肠腺癌细胞的细胞内信号转导，迁移和转移潜能中的作用的机制细节尚不清楚。Korkmaz等[17]报道，结肠直肠腺癌组织中galectin-3的表达显着高于正常肠组织。这些报告得出结论，半乳糖凝集素-3在结肠腺癌的发生和发展中起重要作用，本组研究结果显示，galectin-3在结肠腺癌中的阳性率高于炎性肠黏膜病变组织。在51例结肠腺癌组织中，有淋巴结转移组中galectin-3阳性表达亦高于无淋巴结转移组，差异有统计学意义(P<0．05)。另外，转移淋巴结中galectin-3的阳性率也明显高于有淋巴结转移的结肠腺癌组织，差异有统计学意义(P<0．05)。上述结果说明，galectin-3与结肠腺癌淋巴结的侵袭、转移关系密切，且galectin-3阳性的结肠腺癌患者较galectin-3阴性患者发生淋巴结转移的概率更高，这一结果与Mahmoud等[18]的研究结果类似。因此，galectin-3对促进结肠腺癌的浸润具有重要作用，有可能成为判断结肠腺癌发病与转移的观测指标，对于肿瘤性质及预后的判断具有重要参考价值。

MGMT在结肠腺癌组织中低表达，而galectin-3高表达，两者表达进行Spearman等级相关分析表明，MGMT和galectin-3两种之间呈负相关。因此，笔者推测MGMT的减少或缺失可能增加了galectin-3表达，galectin-3通过与细胞黏附相关分子结合并抑制细胞-细胞和细胞-基质相互作用来调节转移，从而促进了癌变的可能，两者在结肠腺癌发生、发展及侵袭中具有重要作用。

总之，结肠腺癌的转移是患者最大的威胁，也是在治疗中遇到的最大障碍。MGMT、galectin-3与结肠腺癌的发生及进展相关， MGMT表达的降低和galectin-3的高表达促进了结肠腺癌发生、发展，是肿瘤细胞进一步转化和恶变的分子异常事件。因此，MGMT和galectin-3可作为评价结肠腺癌细胞增殖、浸润和转移能力的生物学指标。