清热除湿止痛液的提取工艺研究

潘从泽 李喜香 董云霞2 冯彦俊

1甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2 兰州市肺科医院，甘肃 兰州 730050

清热除湿止痛液是甘肃省中医院协定处方制剂，由秦艽、忍冬藤、防己等十味中药组成，具有清热除湿，通络止痛的功效，用于治疗风湿性、类风湿性关节炎、痛风性关节炎，强直性脊柱炎、肩周炎、颈椎病等属风湿热痹、出现关节疼痛，局部红肿灼热等症。历经多年临床应用效果明显，可显著改善风湿热痹型膝骨关节炎患者关节疼痛、活动受限、局部肿胀，发热等局部和全身症状[1]。现拟将传统汤剂改为便于服用的合剂，对其提取工艺进行研究，转化为医院制剂，更好的为临床服务。方药中秦艽为祛风湿热药，指标成分为龙胆苦苷，具有镇静、镇痛、解热、抗炎等作用[2-4]。本实验采用正交试验，以龙胆苦苷为评判指标，对清热除湿止痛液进行提取工艺优化，找到最佳提取条件，对实际生产有一定指导意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters 2695型HPLC仪，Waters 2998型光电二极管阵列检测器(美国Waters公司)；ABT100-5M电子天平(KERN德国)；MH-5000型可调式电热套(武汉格莱莫检测设备有限公司)；AKRY-UP-1816超纯化水机(成都唐氏康宁科技发展有限公司)；RE 5298A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SB-5200DTR超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 材料 秦艽、忍冬藤、防己等十味药材均购于兰州安泰堂中药饮片有限公司，经甘肃省中医院李喜香主任中药师鉴定，符合2015版《中国药典》药材项下规定；龙胆苦苷对照品(批号110770-201716，中国食品药品检定研究院)，甲醇为色谱纯(批号20171204，天津市福晨化学试剂厂)，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 含量测定[4-7]

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Waters Symm-etry-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇：水=30∶70；流速1.0 mL/min；检测波长：274 nm；柱温：25 ℃。在上述色谱条件下，理论板数以龙胆苦苷峰计应不少于4 000，分离度>1.5，龙胆苦苷对照品、清热除湿止痛液供试品及阴性样品色谱图见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取龙胆苦苷对照品1.08 mg置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。

2.1.3 供试品溶液的制备 按处方比例称取9份含秦艽、忍冬藤、防己等十味药材的混合饮片(78 g)，按拟定的正交试验设计进行水煎煮提取，滤过后浓缩至适量，加入乙醇，使含醇量达55%，静置16小时，抽取上清液，回收乙醇至无醇味，加纯化水至100 mL，得到清热除湿止痛液。精密量取10 mL清热除止痛液置于100 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，微孔滤膜滤过，滤液即为供试品溶液。

2.1.4 阴性样品溶液的制备 按清热除湿止痛液处方和制备工艺制备缺秦艽的阴性样品，按“2.1.3”项下方法制备阴性样品溶液。

2.1.5 线性关系的考察 分别精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液2.5、5、10、15、20 μL，按上述色谱条件依次进样，以进样量(μL)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。其线性回归方程为：y=1 727.834 38x+15.004 19，r=0.999 94(n=5)线性范围：0.52～4.16 μg。

2.1.6 精密度试验 精密吸取“2.1.2” 项下对照品溶液10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果，龙胆苦苷峰面积的RSD为1.24%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 精密吸取“2.1.3” 项下供试品溶液10 μL，分别与放置在0、2、6、10、14、24 h时进样测定，记录峰面积。结果，龙胆苦苷峰面积的RSD为1.39%(n=6)，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.1.8 重复性试验 按处方比例称取处方药材78 g，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，龙胆苦苷峰面积的RSD为1.71%(n=6)，表明本方法重复性良好。

2.1.9 加样回收率试验 按处方比例称取秦艽、忍冬藤、防己等十味药材混合饮片39 g，平行9份，平均分为3组，每组分别按清热除湿止痛液中龙胆苦苷含量的80%，100%，120%精密加入龙胆苦苷对照品，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，共9份，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果，平均加样回收率为99.48%，RSD=1.67%(n=9)，表明该方法可行。结果见表1。

表1 龙胆苦苷加样回收试验结果 (n=9)

2.2 正交试验 以提取时间(A)、加水倍量(B)、空白(C)及提取次数(D)为考察因素[8-9]，以龙胆苦苷含量为指标，按正交L9(34)进行试验，因素水平、正交试验设计及结果和方差分析分别见表2、表3和表4。

表2 因素水平表

表3 L9(34)正交试验设计及结果

表4 方差分析结果

注：F0.05(2，2)=19.00，F0.01(2，2)=99.00

由极差分析结果可以得出，各因素对龙胆苦苷含量影响的大小顺序为： A(提取时间)>B(加水倍量)>D(提取次数)，其最佳工艺为A2B1D2。

由方差分析结果可知，提取时间(A)和加水倍量(B)差异均有显著统计学意义(P<0.01)，而提取次数(D)差异无统计学意义(P﹥0.05)。考虑到药材的提取效果，确定提取次数为3倍，得出最佳提取工艺为A2B1D3，即加水量8倍，提取3次，每次提取50 min。

2.3 验证试验 按照最佳提取工艺A2B1D3分别提取三批处方量药材进行验证试验，按照“2.1.3” 项下方法测定龙胆苦苷的含量，取平均值，结果优于或近似于正交试验的数据。验证结果见表5。

表5 验证试验结果

3 讨论

清热除湿止痛液是由秦艽、忍冬藤、络石藤、桑寄生、薏苡仁等10味中药制成的复方制剂，其中秦艽为君药，传统用于风湿痹痛、筋脉拘挛、骨节酸痛等病症，广泛用于风湿病的治疗，在本院治疗膝骨关节炎疾病的众多案例中，取得了良好的临床效果[1]。秦艽药材中的主要成分以龙胆苦苷为主的裂环环烯醚萜苷类化合物，而龙胆苦苷为其指标性成分[10]，选其为含量测定指标，且对清热除止痛液质量标准的进一步研究有一定的参考作用。

本实验通过正交试验设计对清热除湿止痛液提取工艺进行优化筛选，通过测定龙胆苦苷的含量来评价其内在质量，确定了最佳的提取工艺为加水量8倍，提取3次，每次提取50 min，适合实际生产，可作为后续研究的基础和参考。