鲍鱼水解肽的抗氧化活性评价、 组成分析及稳定性研究

梁 杰， 赵晓旭， 汪秀妹， 杨志强， 汪少芸

(1. 莆田学院环境与生物工程学院， 福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室， 福建 莆田 351100; 2. 福州大学生物科学与工程学院， 福建 福州 350108)

0 引言

生物活性肽具有抗菌[1]、 抗氧化[2-3]、 抑制肥胖[4]、 抗心血管疾病、 抗癌、 神经保护活性、 抗炎症等多种生理功能[5-9]. 鲍鱼是一种营养价值和药用价值较为全面的优质动物蛋白， 由于其高蛋白、 低脂肪、低胆固醇的特点， 加上滋味鲜美的口感， 素有“海味之冠”的美誉. 我国海域辽阔， 鲍鱼资源丰富. 除鲜活鲍鱼外， 罐头鲍鱼、 干鲍鱼是鲍鱼目前的主要销售方式， 加工企业在生产过程中产生大量的内脏下脚料， 造成环境污染. 相关研究[10]证实， 鲍鱼内脏蛋白具有较强抗氧化能力， 说明其中含有抗氧化能力的氨基酸序列和活性物质.

本研究以鲍鱼内脏蛋白为原料， 通过木瓜蛋白酶酶解得到水解肽， 以水解肽清除·OH、 DPPH、 ABTS自由基能力及还原能力为指标对其进行抗氧化评价， 测定其氨基酸含量并对组成成分进行抗氧化稳定性研究， 以期为水产品加工下脚料的开发利用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1试验原料

鲍鱼内脏蛋白由莆田学院环境与生物工程实验室自制； 木瓜蛋白酶购自诺维信(中国)生物技术有限公司； 其它化学试剂均为国产分析纯.

1.1.2仪器设备

冷冻干燥机(FD-1B-55型, 北京博医康实验仪器公司)； 紫外/可见分光光度计(UV2550， 日本岛津公司)； 电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9030A， 上海精宏实验设备有限公司)； 超低温冰箱(MDF-U333型， 日本三洋公司)； 全自动氨基酸测定分析仪(L-8900型， 日本Hitachi公司)； 高效液相色谱仪(Waters TM 650E， 美国Waters公司).

1.2 试验方法

1) 水解工艺流程. 蛋白冻干粉搅拌至完全溶解， 调节至最适条件， 加酶酶解， 在100 ℃下水浴灭酶10 min. 静置冷却后， 以10 000 r·min-1速率离心分离10 min， 移液枪吸取上清液(为酶解液)， 分析测定.

2) 抗氧化活性评价. 参照文献[11]的方法测定·OH自由基清除率； 参照文献[12]的方法测定ABTS自由基清除率和DPPH自由基清除率； 参照文献[13]采用铁氰化钾法测定还原力.

3) 相对分子质量分布测定. 采用HPLC法测定水解肽相对分子质量的分布情况， 由仪器自带的M32工作站软件自动处理数据.

4) 氨基酸组成分析. 参照Wang等[14]的方法， 采用全自动氨基酸测定分析仪进行测定.

2 结果与分析

2.1 鲍鱼水解肽的抗氧化活性评价

按照水解工艺流程， 将足量的酶解液进行真空冷冻干燥， 得到鲍鱼源水解肽冻干粉， 供后续实验使用. 评价抗氧化能力主要通过以下方法测定： ① 清除自由基能力的大小， 如清除羟基自由基、 ABTS自由基、 超氧阴离子自由基、 DPPH自由基、 氮自由基能力, 以及氧自由基吸收能力大小等； ② 测定其还原能力大小[15].

2.1.1·OH自由基清除能力

通过考察不同质量浓度鲍鱼水解肽对·OH自由基清除率来研究它的抗氧化清除效果. 结果如图1(a)所示， 在水解肽质量浓度为0～1.0 mg·mL-1时， 对·OH自由基的清除率随着质量浓度增加呈迅速递增的趋势， 表明水解肽质量浓度与·OH自由基的清除率密切相关； 水解肽质量浓度为1.0 mg·mL-1时， ·OH自由基清除率可达(64.26±0.33)%， 具有较强抗氧化能力； 当水解肽质量浓度为1.0～4.0 mg·mL-1时， ·OH自由基清除率的增长趋势开始趋于平缓， 表明质量浓度升高到一定范围， 水解肽抗氧化能力趋于饱和并维持稳定的状态. 其IC50值(对·OH自由基清除率达到50%时所需的抗氧化剂质量浓度)为0.74 mg·mL-1.

2.1.2ABTS自由基清除能力

不同质量浓度的水解肽清除ABTS自由基的能力如图1(b)所示， 水解肽对ABTS自由基的IC50值为0.031 mg·mL-1. 水解肽质量浓度为0.02～0.08 mg·mL-1时， ABTS自由基清除率快速增长； 浓度继续增加， ABTS自由基清除率增长减慢， 水解肽抗氧化能力接近极限.

2.1.3DPPH自由基清除能力

不同质量浓度水解肽清除DPPH自由基的能力如图1(c)所示， 其IC50值为0.48 mg·mL-1， IC50值与抗氧化能力密切相关， 其值越小， 表明其清除DPPH自由基的能力越强. 当水解肽质量浓度在0.2～1.0 mg·mL-1时， DPPH自由基清除率加快增长， 当水解肽质量浓度为1.0 mg·mL-1时， DPPH自由基清除率为(80.26±0.79)%； 此后水解肽质量浓度在1.0～5.0 mg·mL-1时， 对DPPH自由基的清除率却不再升高， 此时水解肽能够结合的DPPH自由基趋于饱和状态.

2.1.4还原力测定

体系中样品吸光度越大， 还原能力越强， 抗氧化能力也就越强. 可以通过测定还原能力来评价试样抗氧化能力的强弱， 测试结果如图1(d)所示， 鲍鱼水解肽的还原能力随着质量浓度的升高不断增加. 在水解肽质量浓度为0.2～4.0 mg·mL-1时， 其还原力的增加与质量浓度呈正相关. 通过关系曲线计算可得， 其IC50值为2.91 mg·mL-1.

图1 抗氧化活性评价Fig.1 Antioxidant activity evaluation

2.2 水解肽组成成分分析及营养评价

2.2.1水解肽复合物的相对分子质量分布测定

采用HPLC法测定水解肽的相对分子质量， 结果如图2所示. 相对分子质量在107 ～ 10 031 u呈连续分布， 主要分布在180～3 000 u， 占比52.29%； 其中相对分子质量<5 000 u的水解肽占比82.00%； 相对分子质量>10 000 u的成分相对较少， 为2.13%. 表明木瓜蛋白酶酶解较为完全， 水解物中主要含小片段多肽.

图2 水解肽成分分析

表1 鲍鱼水解肽中氨基酸组成及含量

2.2.2氨基酸组成成分分析

氨基酸营养价值高低主要取决于3个因素： ① 蛋白质中是否全面含有各种必需氨基酸； ② 必需氨基酸数量多少； ③ 必需氨基酸的比例是否符合标准[16-17]. 鲍鱼水解肽中氨基酸含量及组成如表1所示， 由18种氨基酸组成， 种类相对齐全， 氨基酸总量高达82.05%， 其中人体必需的8种氨基酸含量为39.30%， 占氨基酸总量47.89%. 含量最高的为苏氨酸， 其次为异亮氨酸、 天冬氨酸和甘氨酸等. 苏柳智等[18]对鲍鱼脏器醇溶性物质的营养分析结果中， 含量最高的氨基酸为谷氨酸， 其次为苏氨酸、 丙氨酸和天冬氨酸. 本试验结果与上述研究结果存在不同， 是由于鲍鱼品种和生长环境以及所处生长期不同对蛋白质中氨基酸组成有较大影响. 其中酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)占总氨基酸的8.21%， 碱性氨基酸(精氨酸、 赖氨酸、 组氨酸)占总氨基酸的6.41%. 疏水性氨基酸(蛋氨酸、 色氨酸、 苯丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 脯氨酸和丙氨酸)占总氨基酸的53.08%. 蛋氨酸(Met)、 苏氨酸(Thr)、 色氨酸(Trp)、 组氨酸(His)是公认的抗氧化氨基酸， 其衍生物及含有这些氨基酸的多肽也具有良好的抗氧化能力， 周雪松等[19]研究表明， 亮氨酸(Leu)、 丙氨酸(Ala)、 脯氨酸(Pro)等氨基酸以及含有这些的小肽具有较好的抗氧化能力. 以上抗氧化氨基酸在鲍鱼脏器氨基酸中百分含量为34.25%， 它们是鲍鱼水解肽具有较强抗氧化能力的主要因素.

2.2.3鲍鱼水解肽营养评价

对氨基酸组成进行分析， 参照李华等[20]的评价方法， 以鸡蛋白为标准蛋白， 以联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO)建议的氨基酸需要模式为标准， 综合评价鲍鱼水解肽营养价值. 化学评分(amino acid or chemical score， CS)和氨基酸评分(amino acid score， AAS)如表2所示， 受第一限制氨基酸影响， 鲍鱼水解肽的化学评分和氨基酸评分均低于FAO/WHO模式和鸡蛋模式， 其中氨基酸评分为31.4， 较为接近FAO/WHO模式. 由表2可知， 除第一限制氨基酸、 Phe+Tyr 、 Lys外， 鲍鱼水解肽中其余氨基酸含量均远高于FAO/WHO模式和鸡蛋模式. 针对以上特征， 在实际应用过程中， 搭配与之互补的原料配方， 解决Met、 Cys、 Phe、 Tyr的欠缺问题， 以期开发出营养价值丰富而全面的功能食品.

表2 鲍鱼脏器水解肽的氨基酸评分和化学评分

注：*代表第一限制氨基酸

2.3 水解肽抗氧化稳定性研究

由于抗氧化肽作为功能食品在加工、 生产、 储存的过程中会受到各种外界条件， 如环境温度、 pH值、 金属离子等条件变化的影响， 且在人体吸收过程中， 经过复杂的胃肠道消化吸收环境， 其多肽序列及空间构象发生改变， 影响抗氧化肽的功能结构， 因此， 研究水解肽的抗氧化稳定性具有重要实际意义.

2.3.1温度对抗氧化稳定性的影响

图3 温度对抗氧化肽稳定性的影响Fig.3 Effect of temperature on antioxidant peptide stability

水解肽在20～100 ℃下分别恒温水浴一定时间后， 其抗氧化稳定性的保持情况如图3所示. 当温度在20～60 ℃时， 水浴时间由2 h延长到5 h， 水解肽清除DPPH自由基能力变化幅度并不明显； 当温度升高到80～100 ℃时， 水解肽的DPPH自由基清除活性显著降低(P<0.05)， 且随着时间的延长继续降低， 当环境温度为100 ℃处理5 h后， DPPH自由基保持率只剩(30.54±0.91)%. 由此可知， 鲍鱼水解肽的抗氧化能力在20～60 ℃保持良好的稳定性， 其抗氧化稳定性处于在(97.77±0.43)%的较高水平； 当温度继续提高到80 ℃时， DPPH自由基保持率开始急速下降， 且随着时间的延长而加剧这一变化反应.

2.3.2pH值对抗氧化稳定性的影响

水解肽在pH值为2～12的条件下反应一定时间后， 其抗氧化稳定性的保持情况如图4所示. 当水解肽处于中性和偏碱性条件(pH值为7， 8， 10)反应3～5 h， DPPH自由基保持率基本维持在恒定水平； 处于偏酸性或偏碱性条件会较大地影响水解肽的抗氧化能力， 强碱性条件下(pH=12)影响更为显著(P<0.05)； 水解化肽在pH值为12的条件下反应3 h后， 其DPPH自由基保持率为(63.32±0.56)%， 反应5 h后， DPPH自由基保持率为(58.37±0.87)%. 水解肽抗氧化能力在强碱条件下显著减弱， 可能是因为肽链氢供体上的氢在强碱条件下被消耗而降低其抗氧化能力， 也可能是因为肽发生消旋作用引起肽链构象改变而降低活性[21].

2.3.3金属离子对抗氧化稳定性的影响

向反应体系中添加一定质量浓度的金属离子， 其抗氧化稳定性的保持情况如图5所示， 随着质量浓度的增加， 不同金属离子对DPPH自由基的影响都逐渐增强， 影响的大小排列为： Cu2+>Zn2+>Ca2+>Mg2+>K+. 当Cu2+的质量浓度为500 μg·mL-1时， DPPH自由基保持率仅为(21.03±0.27)%.

图4 pH值对抗氧化肽稳定性的影响Fig.4 Effect of pH value on antioxidant peptide stability

图5 金属离子对抗氧化肽稳定性的影响Fig.5 Effect of metal on antioxidant peptide stability

2.3.4胃肠道蛋白酶对抗氧化稳定性的影响

体外模拟胃肠道消化， 经过胃蛋白酶消化5 h后， DPPH自由基清除能力仅能保持在(66.03±0.29)%， 比先前有所降低； 经胰蛋白酶消化5 h后， 其DPPH自由基保持率在(109.03±0.57)%， 抗氧化效果有所提高. 这可能是由于胃蛋白酶的特异性作用位点为苏氨酸和色氨酸的氨基端， 经胃蛋白酶水解后原本具有抗氧化能力的肽段被水解为氨基酸残基而使抗氧化活性降低； 胰蛋白酶的特异性位点为精氨酸和赖氨酸的羧基端， 水解肽经胰蛋白酶的作用后具有抗氧化能力的基团被酶解而暴露出来[16].

3 结语

研究以鲍鱼内脏蛋白为原料， 采用酶解技术制备抗氧化水解肽. 该水解肽具有较强的自由基清除能力和还原力， 其主要成分为小片段多肽， 相对分子质量在107～10 031 u； 在20～60 ℃范围内， 温度和时间对水解肽抗氧化性影响不大， 当温度超过80 ℃时， 抗氧化性随着温度和时间增加而明显降低； 随着金属离子质量浓度的增加， 水解肽抗氧化性总体呈现下降趋势， 其中Cu2+的影响最为显著； 经胃蛋白酶消化明显降低了水解肽抗氧化性， 而胰蛋白酶消化则提高了其抗氧化效果.