产表面活性剂菌与稠油降解菌复配对原油黏度的影响*

王大威，张世仑，靖 波，何春百，张 健，马 挺

（1.海洋石油高效开发国家重点实验室，北京 100027；2.中海油研究总院，北京 100027；3.分子微生物学与技术教育部重点实验室，南开大学生命科学学院，天津 300071）

微生物采油技术已有近一百年的历史，20世纪20年代美国Beckman 即指出细菌在油藏中的生长有利于石油开采［1］。稠油微生物开采技术是微生物采油技术的延伸，也是石油界对稠油开采的一种新的尝试。微生物稠油降黏机理主要有两个方面：（1）微生物在地下发酵过程中产生多种生物表面活性剂［2］，可分为糖脂类、脂肽类、磷脂类、脂肪酸类、中性油脂类和聚合物类等。表面活性剂不仅能降低油水界面张力和乳化原油，还能通过改变油层岩石界面的润湿性来改变岩石对原油的相对渗透性，降低稠油的黏度。（2）部分微生物能降低稠油的平均分子量，即微生物能把稠油中的高分子物质如蜡质、胶质、沥青质分解为低分子量的化合物，降低整个稠油的平均分子量，使稠油黏度降低［3-7］。由于表面活性剂只是改变稠油大分子的空间结构，而未改变其化学组成，稠油会由于色谱分离效应而造成黏度恢复，是为可逆反应，可能造成地层渗流通道及井筒堵塞的问题；与之相比，稠油降解降黏原理是微生物降解原油的大分子组分，减小其平均分子量，由于稠油组份发生变化，因此为不可逆反应［8］，一方面可明显改善原油流动性，另一方面可通过降低原油分子量提高原油品质。

在微生物降解稠油过程中，原油的疏水性是限制其降解速率的主要因素之一［8-9］。最新的研究结果表明［9］，某些细菌可以通过产生生物表面活性剂而促使原油乳化并被动扩散进入细胞内或细胞外，从而被生物酶捕集降解。目前该技术已在污染土壤的生物修复中得到广泛应用。由于稠油是由结构复杂、并难于降解的化合物，如芳烃、胶质、沥青质组成，单一的菌株对其降解较差。利用不同稠油降解菌株作用可将芳环和杂环结构破坏后进一步降解，同时产表面活性剂菌株代谢的生物表面活性剂可乳化增溶原油，更加利于降解菌对它的摄取和降解速率。笔者将多种产表面活性剂菌与稠油降解菌复配，通过黏度测定、四组分分析、变性梯度凝胶电泳（Denature Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）等方法研究生物表面活性剂对稠油生物降解的强化作用，分析微生物降解稠油机理，为微生物采油技术的现场应用提供技术支持。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

渤海N油田A18井原油，黏度（25℃）1146 mPa·s，含沥青7.79%、胶质20.25%；A18 井地层水，矿化度7285 mg/L、离子组成（单位 mg/L）为：Ca2+53.44、Mg2+4.71、K+21.74、Na+628.2、Mn2+0.083、CH3COO-48、NO3-0.1、SO42-3、Cl-120；LB培养基配方（单位g/L）：胰蛋白胨 10、酵母提取物（Yeast extract）5、NaCl 10；发酵培养基配方（单位g/L）：Na2HPO40.6、KH2PO40.2、NaNO32、FeSO40.02、MgSO40.3、酵母粉 0.5、蔗糖 1，pH 值 7.2；产表面活性剂菌：T-1（Pseudomonas aeruginosa，铜绿假单胞菌属）、X-3（Bacillus Subtilis，枯草芽孢杆菌），由实验室分离保存；稠油降解菌：QB26（Bacillus licheniformis，地衣芽孢杆菌）、QB36（Geobacillus pallidus，白色地芽孢杆菌），由实验室从渤海N油田地层油水样分离保存；苯、丙酮、甲苯、正庚烷、石油醚，北京百灵威科技有限公司。

Brook field Viscometer LVDV-II+Pro 提桶式旋转黏度计，美国Brookfield 公司；混合纤维素酯滤膜，孔径0.22 μm，美国默克密理博公司；DNA 纯化试剂盒、PCR引物，北京天为时代生物技术公司；氧化铝色谱柱，美国赛默飞世尔公司；YLN 22000凝胶影像分析系统，北京亚力恩机电技术研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种培养方法

挑取不同细菌单菌落置于5 mL LB 培养基中，在55℃、120 r/min下震荡培养过夜，然后取1 mL菌液接种到100 mL LB 培养基中培养4 h 作为种子液。取种子液5%分别接种到发酵培养基中，在55℃、120 r/min下震荡培养过夜，备用。

1.2.2 黏度的测定

将30 mL产表面活性剂菌、降解菌、或二者复配菌株发酵液与30 g原油体系混合，55℃摇床培养14 d。在 4号转子、55℃和 400 r/min 的条件下，用旋转黏度计测定油水混合体系的黏度。

1.2.3 原油四组分分析

参照石油天然气行业标准SY/T 7550—2012《石油中蜡、胶质、沥青质测定法》进行原油四组分分析。利用氧化铝吸附色谱法得到的油蜡组分，以苯-丙酮（体积比1∶1）为脱蜡溶剂，经冷冻至-20℃结晶析出的组分即为蜡；预处理后的原油在氧化铝色谱柱上吸附，用石油醚和苯冲洗时不能脱附的部分扣除沥青质后的组分即为胶质；原油中不溶于正庚烷、溶于甲苯的组分即沥青质。一份试样经蒸馏后用正庚烷加热溶解沉淀出沥青质，滤出不溶物，并用正庚烷回流除去不溶物中夹杂的油蜡及胶质后，用甲苯回流溶解沥青质，除去溶剂，求得沥青质的含量。另一份试样经蒸馏后用石油醚溶解、苯溶剂冲洗，通过氧化铝色谱柱吸附分离出油蜡部分，再以苯-丙酮混合物为脱蜡溶剂，在-20℃下用冷冻结晶法脱蜡测定原油中的蜡含量。用差减法计算得到胶质含量。

1.2.4 变性梯度凝胶电泳（DGGE）

（1）基因组DNA的提取与纯化。培养菌液菌体处理：取1.2.1 节培养的10 mL 培养液，在高速离心机上以6000 r/min 的速度离心10数15 min 获得菌体。具体操作步骤与文献［10］相同。用DNA 纯化试剂盒提取与纯化基因组DNA，按照操作说明进行。

（2）16S rDNA 的PCR 扩增。采用可得到更多微生物多样性信息的V9区引物进行细菌16S rDNA PCR扩增。因要进行DGGE分析，故此处的引物带GC 夹子。细菌V9 区引物的序列为：1406r-GC：5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCCC ACG GGC GGT GTG TAC-3'；1055f：5'-ATG GCT GTC GTC AGC T-3'。PCR体系组成为：12.5 μL Premix Taq酶、0.3 μL引物1406r-GC、0.3 μL引物1055f、1 μL模板、二次蒸馏水加至总体积为 25 μL。PCR 程序为：①94℃ 5 min、94℃ 45 s、60℃ 45 s、72℃ 90 s（×3 cycle），②94℃45 s、58℃ 45 s、72℃ 90 s（×3 cycle），③94℃ 45 s、56℃ 45 s、72℃ 90 s（×3 cycle），④94℃ 45 s、54℃ 45 s、72℃ 90 s（×3 cycle），⑤94℃ 45 s、52℃ 45 s、72℃90 s（×3 cycle），⑥94℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 90 s（×15 cycle），⑦72℃ 10 min、4℃ 48 h。

（3）16S rDNA 序列的 DGGE 分析。将纯化好的PCR样品加入制备好的琼脂糖凝胶（制备方法见文献［10］）中进行电泳分离，通过YLN22000凝胶影像分析系统观察每个样品的电泳图谱并拍照。

2 结果与讨论

2.1 产表面活性剂菌对原油界面张力的影响

T-1 菌为铜绿假单胞菌属，产生的鼠李糖脂（rhamnolipid）分子量较大，具有较强的乳化增溶作用，易形成低黏度乳状液；X-3 菌为枯草芽孢杆菌，产生的脂肽（lipopeptide）分子量较小，具有较强的降低界面张力的能力。T-1产生的鼠李糖脂、X-3产生的脂肽可分别将原油的界面张力从29 mN/m 降至0.76 mN/m 和0.43 mN/m。尽管鼠李糖脂降低油水界面性能弱于脂肽，但其对原油有较强的乳化作用，因此分别对这两种表面活性剂开展下一步复配性能研究。

2.2 降解菌和产表面活性剂菌的降黏性能

产表面活性剂菌通过表面活性剂的乳化作用降低原油黏度，而稠油降解菌通过降解稠油中重组分、降低平均分子量进而降低原油黏度。将降解菌和产表面活性剂菌分别单独与稠油混合，经两种降解菌QB26 和QB36 作用后，原油（作用前黏度为1146 mPa·s）黏度分别降至384 mPa·s 和 478 mPa·s，降黏率分别为64.7%和58.4%；两种产表面活性剂菌T-1 和X-3 作用后，原油黏度分别降至96 mPa·s和110 mPa·s，降黏率分别为91.6%和90.4%。表面活性剂作用后的原油表观黏度明显低于稠油降解菌作用后的值，表明在一般的微生物采油过程中，由乳化产生的降黏作用强于由降解产生的降黏作用。

2.3 降解菌和表面活性剂菌复配后的降黏性能

2.3.1 不同降解菌株复配比

原油是一种由烃、非烃组成的复杂混合物，单一菌种对原油的降解作用具有较强的选择性和单一性［12］，效果相对受限。因此利用混合菌作用原油可产生较好的共生协同效应，可降解原油中多种成分，特别对原油中的胶质、沥青质等具有芳环或杂环结构的大分子物质，更需要不同菌种复配的协同作用进行降解。

将QB26和QB36菌液按不同体积比（1∶5、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、5∶1）混合后加入原油中，测得的原油黏度分别为 453、426、445、407、439、441、435 mPa·s。当菌种复配体系在体积比为1∶1时，原油黏度降至最低。此时两种降解菌可以产生较好的协同效应，通过降解不同原油成分，促进互相的菌体生长，形成了互生互养的群落结构。因此确定两种降解菌种QB26和QB36复配的体积比为1∶1。

2.3.2 不同产表面活性剂菌复配比

通常，单独使用一种表面活性剂时电性排斥作用较强，疏水链的结构多种多样，在界面上排列不紧密，界面活性不高。若添加分子结构适宜、有协同作用的辅助表面活性剂，少量即可大大提高油水界面活性，提高驱油效率，同时又可减少形成稳定的O/W 型乳状液所需降黏剂的总量，降低使用成本［13-14］。研究发现［15-16］，鼠李糖脂与其他表面活性剂复配后的界面活性明显优于未复配的表面活性剂。X-3 菌种产生脂肽分子量较小，具有较强的降低界面张力的能力，且价格便宜。考虑到鼠李糖脂和脂肽分子量和结构间的差异，可获得更好的界面分布，产生更好的界面活性，因此将两种产表面活性剂菌产生的生物表面活性剂菌液复配使用。将T-1 菌种发酵液（含有鼠李糖脂）和X-3 菌种发酵液（含有脂肽）按不同体积比（1∶5、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、5∶1）复配，再与A18 原油混合，测得的黏度分别为 342、286、143、86、75、66、40 mPa·s。由于T-1菌产生大量鼠李糖脂，可较好的乳化原油，因此T-1菌含量越高，原油黏度越低。但X-3 菌产生的脂肽可有效降低油水界面张力，而油水界面张力的降低是影响驱油效率的重要因素。因此，考虑到T-1 菌和X-3 菌在体积比1∶1 的情况下与T-1 含量较高时的原油黏度相差较小，将T-1菌与X-3菌复配的体积比确定为1∶1。

2.3.3 降解菌和产表面活性剂菌复配比

表面活性剂对降解菌提高降解效率具有明显的强化作用，因此将筛选得到的产表面活性剂菌（T-1 与X-3 菌复配体积比1∶1）和降解菌（QB26 和QB36 复配体积比1∶1）按不同体积比（1∶6、1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1）复配后与原油混合，测得的黏度分别为 436、385、295、176、97、65、59 mPa·s。当产表面活性剂菌和降解菌的比值最大时，黏度达到最低值，表明增大产表面活性剂菌的加量，有助于原油体系的降黏。但同时要考虑降解作用对稠油整体降黏的影响，以及表面活性剂的发酵成本，因此T-1、X-3、QB26、QB36菌适宜的体积比为2∶2∶1∶1。

2.3.4 不同菌种复配体系的降黏性能

将30 mL QB26、QB36、T-1、X-3、QB26+QB36、T-1+X-3、T-1+X-3+QB26+QB36 与 30 g 原油混合，原油的黏度由混合前的1146 mPa·s 分别降至384、478、6、386、471、207、5 mPa·s。与混合前原油黏度相比，T-1 菌产生的鼠李糖脂降黏率可达99.5%，QB26 菌通过降解作用对原油的降黏率为66.5%，T-1+X-3+QB26+QB36体系降黏率也可达到99.6%，降黏率提高33.1%。尽管生物表面活性剂可大幅降低原油黏度，但原油乳化降黏过程是一种可逆过程，当在采出端原油饱和度高的情况下，可能因乳化反转或破乳而发生增黏，从而影响开发效果，同时乳化原油对现场采出液的处理也会产生较大影响；与之相反，尽管降解作用的降黏幅度不如乳化过程，但降解作用改变原油组成物性，是一个不可逆过程，对提高采收率、提升原油品质、降低采出液处理难度都有重要作用。

2.4 不同组合菌种降解后原油四组分分析

将QB26、QB36、T-1、X-3 四株菌液以体积比1∶1∶2∶2复配作用于稠油后的稠油四组分分析结果见表1。与空白相比，降解菌QB26、QB36 作用稠油后，各组分的相对含量均发生了变化，饱和烃相对含量均有不同程度的上升，芳香烃、胶质、沥青质相对含量降低。其中，QB26 菌使胶质相对含量降低5.1%、沥青质相对含量降低2.7%，表明稠油经微生物作用后，其化学组分发生了一定程度的变化。QB26、QB36两种降解菌复配后，对稠油中胶质和沥青质的降解性能有一定提升，但并不明显，说明两种降解菌在底物选择上具有一定重叠性，尚未发挥不同菌种对多种底物选择的优势。将降解菌与产表面活性剂菌复配后，对胶质和沥青质的降解性能有进一步的提升。未加入产表面活性剂菌前，微生物降解作用主要针对胶质沥青质中相对轻质的组分，降解微生物自身也会产生一定量表面活性剂乳化原油，但含量有限；而产表面活性剂菌的加入增加了油水体系内表面活性剂含量，从而进一步提升了降解微生物的活性，降低了胶质沥青质中相对重质组分的含量，尽管含量变化不大，但从之前降黏率数据分析，重质组分的降解对原油降黏的意义重大。降解菌与产表面活性剂菌复配后，胶质降解率分别比 QB26、QB36、QB26+QB36 提高 7.8% 、9.4%、6.9%，平均提高8.0%，沥青质降解率分别提高4.6%、5.5%、4.6%，平均提高4.9%，说明产表面活性剂菌的加入对降解大分子物质、改善原油品质作用明显。

表1 不同菌种组合降解原油后四组分相对含量变化

2.5 不同组合菌种降解原油后变性梯度凝胶电泳分析

变性梯度凝胶电泳（DGGE）是检测DNA 突变的一种电泳技术，是一种通过分离微生物基因组DNA 来研究环境样品中微生物群落的多样性及物种丰度的一种分子指纹技术［17-19］。在两种降解菌、两种产表面活性剂菌及四种菌复配后作用原油的溶液体系中提取菌群DNA，并进行DGGE 分析，结果见图1。PCR 条带亮度表明体系中微生物的浓度，泳道6中QB26、QB36的亮度明显高于泳道5，结合之前黏度测定和四组分分析结果，表明产表面活性剂菌通过产生表面活性剂，使原油降黏增溶形成小液滴，易于被稠油降解菌捕获降解。一方面降低了稠油黏度，改善了稠油品质，另一方面提升了稠油降解菌数量。在泳道6中，QB26条带亮度高于QB36，说明QB26在岩心中可利用稠油作为碳源进行扩增，因其利用稠油和营养的能力更强，在菌群分布中处于统治地位；QB36同样作为稠油降解菌，因其在地层中利用稠油和注入营养液的能力比QB26低，因此造成其扩增速度低于QB26，数量少于QB26。

图1 降解菌和产表面活性剂菌复配作用于原油后的变性梯度凝胶电泳照片

3 结论

在稠油微生物降解过程中，产表面活性剂菌的加入可明显提高稠油降解菌的降解活性，在降低稠油黏度的同时改善稠油物性。产表面活性剂菌与稠油降解菌的复配体系对稠油的作用大于单独使用稠油降解菌或者产表面活性菌。产表面活性剂菌与稠油降解菌的复配组合对稠油降黏的影响较大，产表面活性剂菌T-1、X-3与降解菌QB26、QB36适宜的体积比为2∶2∶1∶1。