罗汉果苷IIIE的酶法定点糖基化修饰

李程飞，陈 玲，吴旭日

(中国药科大学生命科学与技术学院化学生物学研究室，南京 210009)

罗汉果(Siraitiagrosvenorii)学名光果木鳖，为葫芦科罗汉果属草本植物，主要分布在我国广西、湖南、贵州等地区，药食两用。罗汉果果实中的主要活性成分为葫芦烷型四环三萜类皂苷[1-2]，即罗汉果苷元(10α-cucurbit-5-ene-3β,11α,24(R),25-tetraol)，罗汉果苷元属于连接2～6个葡萄糖单元所形成的系列化合物[3]。近些年的研究发现，罗汉果苷类化合物不仅具有抗炎[4]、抗氧化[5]、降血糖[6]、降血脂[7]等多种生物活性，而且还展现出一定的抗肿瘤活性[8]，已成为新药研发的重要先导化合物来源之一。与此同时，甜度高、热量低、口味更加纯正和安全性好的罗汉果甜苷类化合物就成为非营养型天然甜味剂开发的热点，有望被开发成新一代优良商业用糖[9]。

目前，从罗汉果中提取、分离得到的罗汉果苷已超过30种，它们的苷元骨架基本相同，主要区别点在于糖基数目、糖苷键类型和立体构型以及甜度和口感[1]。甜味构效关系研究发现，罗汉果苷元的3位和24位羟基连接的葡萄糖单元总数超3个是罗汉果苷具有较高甜味和较好口感的结构基础，例如罗汉果苷IIIE、IV、V和赛门苷I(siamenoside I)等[1,10]。此外，研究人员推测罗汉果苷元的11位羟基与甜度及口感关系密切，但由于罗汉果苷糖基上的活泼羟基较多，所以一直难以采用化学方法定点修饰苷元的11位羟基以阐释该构效推测[1,3,10]，在一定程度上阻碍了罗汉果苷的构效改造和深度开发利用。

鉴于糖基转移酶的高效区域选择性特征，本研究以口感较好、甜度为5%蔗糖300倍的罗汉果苷IIIE为模型底物[1]，筛选糖基转移酶库后获得能特异性葡萄糖基化修饰模型化合物11位羟基的糖基转移酶HXSW-GT-2(图1)。在此基础上，通过酶诱导表达条件和生物催化条件的系统考察，将罗汉果苷IIIE 11位羟基定点糖基化修饰的效率提高至85%以上，并扩大反应后纯化制备纯度大于95%的产物MG-IIIE-Glu。口感测试结果显示，MG-IIIE-Glu基本无甜味，且呈现出明显的苦涩感，本研究初步阐释了11羟基对罗汉果苷甜度和口感的重要性，为该类天然甜味剂的改造和深度开发提供构效依据。

Figure1 Enzymatic synthesis of MG-IIIE-Glu from mogroside IIIE

1 材 料

1.1 主要试剂和材料

罗汉果苷IIIE(成都德思特生物技术有限公司)；氨苄青霉素、异丙基硫肽半乳糖苷(IPTG)(上海生工生物工程有限公司)；乙腈和甲酸(色谱纯，美国Tedia公司)；蛋白质相对分子质量标准(美国Fermentas公司)；蛋白质浓度测定试剂盒(江苏凯基生物技术有限公司)；蛋白胨和酵母粉(英国Oxoid 公司)；二磷酸尿苷葡萄糖二钠盐(UDP-G，南京康满林化工实业有限公司)；其余试剂均为市售分析纯。糖基转移酶库(共34种)由中国药科大学化学生物学研究室前期构建。

1.2 仪 器

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent科技有限公司)；Beckman Microfuge16离心机(美国Beckman Coulter有限公司)；蛋白质电泳仪(美国Bio-Rad公司)；YMC-Pack ODS-A C18色谱柱、C18硅胶填料(日本YMC股份有限公司)；冷冻干燥机(上海Christ仪器有限公司)；pH计(瑞士Mettler-Toledo公司)；微孔板恒温振荡器MB100-4A(杭州奥盛仪器有限公司)。

2 方 法

2.1 罗汉果苷IIIE和糖基化产物MG-IIIE-Glu的HPLC分析

色谱条件：色谱柱为Agilent C18反相柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相A为去离子水(加0.1%甲酸)；流动相B为乙腈(加0.1%甲酸)。洗脱梯度为有机相B 10%～90%，梯度时间为25 min。反应液样品进样10 μL，柱温为30 ℃；流速为1 mL/min；检测波长为210 nm。在该色谱条件下，罗汉果苷IIIE和MG-IIIE-Glu的保留时间分别为12.8和9.3 min。

2.2 糖基转移酶库的诱导表达和筛选

在糖基转移酶筛选时，酶库中所有酶的诱导表达条件统一为：0.2 mmol/L IPTG、诱导温度16 ℃、诱导时间12 h。诱导表达完成后，离心收集菌体，用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤稀释菌体至10 g/L，然后加入罗汉果苷IIIE至2 mg/mL，UDP-G至5 mg/mL，于30 ℃，220 r/min反应14 h。反应结束后，用等体积甲醇终止反应，12 000 r/min离心10 min，取上清液进行HPLC和LC-MS分析，以考察罗汉果苷IIIE的糖基化修饰情况。

在筛选出可催化罗汉果苷IIIE糖基化修饰的糖基转移酶HXSW-GT-2后，放大反应体系至100 mL(转化效率仅约为36%)，利用制备液相色谱仪纯化出纯度大于95%的糖基化产物以进行结构鉴定。制备液相的色谱条件为：色谱柱为Waters反相柱(35 mm× 150 mm,5 μm)，流动相A为去离子水(加0.1%甲酸)；流动相B为乙腈(加0.1%甲酸)。洗脱梯度为有机相B 59%～66%，梯度时间为15 min。

2.3 HXSW-GT-2的诱导表达条件考察

在0.2 mmol/L IPTG和诱导12 h条件下，考察诱导温度为15，20，25，30，35 ℃时的HXSW-GT-2可溶性表达量。在25 ℃和诱导12 h条件下，考察IPTG浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L时的HXSW-GT-2可溶性表达量。在优化后的诱导温度和IPTG浓度条件下，考察诱导表达时间为4～16 h时的HXSW-GT-2可溶性表达量。

2.4 HXSW-GT-2酶催化反应条件考察

为提高罗汉果苷IIIE的糖基化产物MG-IIIE-Glu的转化率，制备可供甜度和口感测试的样品，本研究对HXSW-GT-2生物合成MG-IIIE-Glu的反应温度、反应pH、糖供体UDP-G用量和含HXSW-GT-2的菌体用量等参数进行了单因素考察。反应温度考察范围为30～60 ℃；反应pH考察范围为4.0～10.0，种类为：0.1 mol/L Tris-HCl(7.5～10.0)、0.05 mol/L NaOAc-HAc(4.0～5.6)、0.05 mol/L Na2HPO4-柠檬酸(5.4～7.0)；糖供体与底物物质的量比考察范围为1∶1～20∶1；全细胞反应菌体质量的考察范围为5～25 g/L。所有考察反应的总体积均为2 mL，反应时间均为14 h。

2.5 反应体系的放大验证和MG-IIIE-Glu的制备

在最优反应条件下，将MG-IIIE-Glu的生物合成体系扩大至0.5 L，并于不同反应时间点取样监测反应进程。反应结束后，反应液煮沸5 min，离心去除变性的蛋白质，上清液冷冻干燥制备MG-IIIE-Glu粗品。利用C18反相色谱柱(内径2 cm，长度75 cm)分离纯化MG-IIIE-Glu，洗脱液为含45%乙腈的水溶液。HPLC监测纯化过程，收集含高纯度MG-IIIE-Glu的洗脱液，干燥后获得终产品。

2.6 MG-IIIE-Glu的甜度和口感测试

挑选20名健康人员组成评定小组(10男，10女)，分别品尝对比5%蔗糖溶液与质量体积比浓度分别为0.1%、0.05%、0.025%、0.017%、0.012 5%、0.01%、0.008 3%的罗汉果苷IIIE和MG-IIIE-Glu溶液的甜度和口感风味。

3 结 果

3.1 糖基转移酶的筛选

课题组前期将34种不同的糖基转移酶基因分别插入pET22b(+)或pET28a(+)载体获得相应重组质粒，分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3)后构建了糖基转移酶库。本研究采用统一的诱导表达条件(0.2 mmol/L IPTG、诱导温度16 ℃、诱导时间12 h)对酶库进行诱导表达，然后构建全细胞生物合成体系筛选能够区域选择性糖基化修饰模型底物罗汉果苷IIIE的糖基转移酶。分析结果显示，有3个糖基转移酶能够催化罗汉果苷IIIE进行葡萄糖糖基修饰(图2)，经来源分析，这3种酶分别为来源自Streptomycesantibioticus的UDP-G依赖的糖基转移酶OleD(酶库中编号：HXSW-GT-2)[11]、OleD突变体ASP(酶库中编号：HXSW-GT-9)[11-12]和突变体TDP16(酶库中编号：HXSW-GT-24)[12]。鉴于HXSW-GT-2催化罗汉果苷IIIE糖基化修饰的转化率最高，可达到36%，所以本研究选择HXSW-GT-2作为生物催化剂进行后续实验研究。

Figure2 Glycosylation of mogroside IIIE by HXSW-GT-2
A：HPLC analysis of mogroside IIIE and glycosylation of mogroside IIIE by HXSW-GT-2,HXSW-GT-9,HXSW-GT-24.B：LC-MS analysis of glycosylated mogroside IIIE

3.2 罗汉果苷IIIE糖基化产物的结构鉴定

在LC-MS确定糖基转移酶HXSW-GT-2能够催化合成葡萄糖基化罗汉果苷IIIE后，反应体系被放大至100 mL，制备获得纯度大于95%的白色粉末状糖基化产物8 mg，并进行了核磁光谱结构鉴定。核磁共振鉴定罗汉果苷IIIE糖基化修饰产物的结果为：1H NMR(500 MHz,Pyridine-d5)δ：0.82(3H,s),0.87(3H,s),0.98(1H,m),1.05(3H,s),1.08(1H,m),1.08(3H,d,J=6.3 Hz),1.37(3H,s),1.45(3H,s),1.47(3H,s),1.51(3H,s),1.57(1H,m),1.62(1H,d,J=7.1 Hz),1.68(1H,m),1.70(1H,m);1.79(1H,m),1.80(1H,m),1.82(1H,m),1.85(1H,m),1.87(1H,m),1.87(1H,m),1.98(1H,m),1.98(1H,m),2.11(1H,m),2.23(1H,m),2.24(1H,m),2.64(1H,dd,J=11.5,6.5 Hz),2.82(1H,d,J=9.1 Hz),3.63(1H,t,J=7.0 Hz),3.92(1H,m),3.93(1H,m),3.94(1H,m),3.95(1H,m),3.96(1H,m),3.97(1H,dd,J=7.3,8.4 Hz),4.10(1H,dd,J=8.2,8.8 Hz),4.14(1H,dd,J=7.6,8.5 Hz),4.17(1H,m),2.28(1H,m),4.17(1H,t,J=8.5 Hz),4.19(1H,t,J=8.8 Hz),4.22(1H,m),4.25(1H,t,J=7.3 Hz),4.27(1H,dd,J=8.4,8.8 Hz),4.30(1H,t,J=8.5 Hz),4.30(1H,dd,J=10.7,5.2 Hz),4.38(1H,dd,J=10.6,5.0 Hz),4.38(1H,dd,J=10.7,5.1 Hz),4.38(1H,dd,J=10.8,5.2 Hz),4.51(1H,d,J=10.6 Hz),4.51(1H,d,J=10.7 Hz),4.51(1H,d,J=10.7 Hz),4.53(1H,d,J=10.8 Hz),4.85(1H,d,J=7.3 Hz),4.86(1H,d,J=7.3 Hz),5.06(1H,d,J=7.6 Hz),5.28(1H,d,J=7.7 Hz),5.40(1H,dd,J=5.4 Hz);13C NMR(125 MHz,Pyridine-d5)δ：16.9,19.1,19.1,24.5,25.8,25.8,26.2,26.2,27.1,27.7,27.9,28.3,29.5,33.6,34.3,36.1,36.7,36.8,39.7,42.2,43.7,47.1,49.4,50.6,62.5,62.9,63.2,63.2,71.4,71.8,72.1,72.2,72.3,75.4,75.5,76.1,78.0,78.1,78.2,78.3,78.4,78.4,78.6,78.8,84.0,86.3,87.4,87.6,101.5,103.5,106.3,107.3,118.2,143.6。核磁结果表明，HXSW-GT-2催化合成的糖基化产物为罗汉果苷IIIE的11-位羟基的β-葡萄糖基化修饰产物，命名为MG-IIIE-Glu(图3)。

Figure3 Identification of MG-IIIE-Glu from HXSW-GT-2

3.3 HXSW-GT-2的可溶性表达

为进一步提高HXSW-GT-2的催化产率，制备出可供甜度和口感测试的MG-IIIE-Glu，本研究主要对影响大肠埃希菌中重组蛋白异源表达的诱导剂用量、诱导温度和诱导时间等参数进行了系统考察[13]，以期提高HXSW-GT-2的可溶性表达量。如图4-A所示，HXSW-GT-2在SDS-PAGE中测定的相对分子质量约为45 kD，与计算相对分子质量为44.6 kD基本一致。大肠埃希菌中重组蛋白的可溶性表达情况对温度较为敏感，诱导温度过高容易错误折叠形成包涵体，温度过低则会导致菌体生长缓慢，重组蛋白的表达量降低。如图4-B所示，当诱导温度为25 ℃时，HXSW-GT-2可溶性表达量最佳，约占可溶性总蛋白的21.1%。诱导剂IPTG的用量是影响大肠埃希菌中重组蛋白表达量和可溶性的重要因素。如图4-C所示，0.4 mmol/L IPTG浓度时，HXSW-GT-2的可溶表达量达到峰值，约占可溶性总蛋白的22.3%，随着IPTG浓度进一步提高而逐渐下降。在0.4 mmol/L和25 ℃条件下，HXSW-GT-2的表达量在12 h时达到最高值25.8%(图4-D)。因此，HXSW-GT-2的最佳可溶性表达条件确定为：0.4 mmol/L IPTG、25 ℃和12 h。

3.4 MG-IIIE-Glu生物合成的最佳条件

3.4.1 最佳反应温度 酶促反应速率与温度密切相关，反应温度升高可增加底物分子的热能，提高反应速率，但温度过高会导致酶蛋白的变性失活[14-15]。本研究考察了30～60 ℃条件下HXSW-GT-2催化合成MG-IIIE-Glu的产率。如图5-A所示，当反应温度为37 ℃时，MG-IIIE-Glu的产率达到了最大值，约为41%；但是当反应温度高于37 ℃后，MG-IIIE-Glu的产率随着温度升高逐渐降低，这可能是HXSW-GT-2变性失活所致。因此，选择37 ℃作为进行后续反应条件的优化。

3.4.2 最佳反应pH 反应pH不仅可以通过改变酶活性中心催化氨基酸残基的离子化状态进而影响酶的催化效率，而且过高或过低的pH还会引起酶的失活[14-15]。本研究采用不同的缓冲液类型，考察了pH 4.0～10.0条件下HXSW-GT-2生物合成MG-IIIE-Glu的情况。如图5-B所示，HXSW-GT-2的催化效率对反应pH变化较为敏感，其催化罗汉果苷IIIE合成MG-IIIE-Glu的最适pH为8.0。

3.4.3 最佳糖供体UDP-G用量 HXSW-GT-2是一种UDP-G依赖的糖基转移酶，催化罗汉果苷 IIIE 合成MG-IIIE-Glu的反应过程中需要添加糖基供体UDP-G[16]，但糖供体UDP-G可能会对HXSW-GT-2产生底物抑制[15]。因此，本研究以UDP-G与底物罗汉果苷IIIE的物质的量比作为考察参数以确定最佳UDP-G用量。结果如图5-C所示，当UDP-G与罗汉果苷IIIE的物质的量比为10∶1时，MG-IIIE-Glu的产率最高，达到82.6%。

3.4.4 最佳生物催化剂用量 在MG-IIIE-Glu的生物合成过程中，生物催化剂为表达HXSW-GT-2的大肠埃希菌细胞。在10 g/L罗汉果苷IIIE质量浓度下，本研究考察了不同用量全细胞生物催化剂与MG-IIIE-Glu产率的关系。如图5-D所示，当全细胞催化剂质量浓度达到10 g/L时，MG-IIIE-Glu的产率即达到平台期，不会随着细胞质量浓度的增加而提高，因此选择10 g/L的全细胞生物催化剂用量进行MG-IIIE-Glu的纯化制备。

3.5 MG-IIIE-Glu的制备

在确定MG-IIIE-Glu的最佳生物合成条件后，本研究将反应体系放大至0.5 L规模(罗汉果苷IIIE为5 g)以制备MG-IIIE-Glu用于甜度和口感测试。与此同时，通过反应进程的监测发现，在反应12 h时，MG-IIIE-Glu产率即达到最高值85.6%，且随着反应时间的推移并未出现提升情况(图6-A)。在反应结束后，反应液经过加热、离心和冻干，获得淡黄色粗品5.4 g。粗品经C18反相色谱柱一步纯化和洗脱液浓缩冻干后获得纯度为97.8%的白色粉末状MG-IIIE-Glu 0.86 g(图6-B)，完全达到了甜度和口感测试的质量和用量要求。

3.6 MG-IIIE-Glu的感官评价

罗汉果苷IIIE是一种低热量高甜度的天然甜味剂，甜度约为5%蔗糖的300倍，且口感较好[1]。以罗汉果苷IIIE和5%蔗糖为参照，20人的评定小组一致认为MG-IIIE-Glu的甜度显著低于5%蔗糖和同浓度的罗汉果苷IIIE，基本无甜味，无持久口感，且苦涩味非常明显。该结果表明，苷元结构中的11位羟基的状态对罗汉果苷的甜度和口感影响明显，其一旦被修饰，罗汉果苷的甜味即有可能消失，产生明显的苦涩味。该构效关系的实验阐释将加强研究人员对罗汉果苷类天然甜味剂甜度和口感结构基础的认知，从而为寻找和开发新的非营养型天然甜味剂提供一定的构效关系理论指导。

4 讨 论

罗汉果苷是一类由罗汉果苷元(10α-cucurbit-5-ene-3β,11α,24(R),25-tetraol)连接2～6个糖单元的四环三萜皂苷，目前从罗汉果中发现的皂苷种类已超过30种[1]。低热量、高甜度和口感好的罗汉果苷已成为非营养型天然甜味剂开发的重要来源之一，具有巨大的潜在商业价值和应用前景[1,9]。前期研究发现，罗汉果苷元连接3个及以上糖单元是罗汉果苷产生甜味和较好口感的结构基础，例如甜度是蔗糖500以上的赛门苷Ⅰ[1-3]。后续研究发现罗汉果苷元的11位羟基与甜度和口感存在一定的关联，但由于罗汉果苷糖单元中的活泼羟基较多，所以一直未能找到合适的方法对苷元的11羟基进行定点结构修饰，也未能以实验阐释其与甜度和口感的构效关系[1,3,10]。

本研究以甜度为蔗糖300倍的罗汉果苷IIIE为模型底物筛选已有的糖基转移酶库，发现HXSW-GT-2可催化罗汉果苷IIIE的11位羟基糖基化修饰生成产物MG-IIIE-Glu，但产率偏低。在此基础上，优化诱导表达条件后确定了HXSW-GT-2在大肠埃希菌中的最佳可溶性表达条件：0.4 mmol/L IPTG、25 ℃和12 h。然后，在确定优化确定最佳反应条件(pH 8.0、30 ℃、UDP-G/罗汉果苷IIIE的物质的量比10和全细胞催化剂10 g/L)后，放大反应体系纯化制备出纯度为97.8%的MG-IIIE-Glu。感官评价结果显示，苷元结构中的11位羟基一旦被修饰，罗汉果苷的甜味即有可能消失，产生明显的苦涩味。该构效关系的研究将进一步深化对罗汉果苷类甜味剂甜度和口感的认知，为罗汉果苷的构效改造和产业开发提供理论指导。